【摘要】：口腔癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,占全身惡性腫瘤的5%-6%,5年生存率僅為50%。由于口腔癌解剖位置特殊,常累及口腔頜面部重要的器官和組織結構,對于該腫瘤的治療提出了更高的要求�？谇话┑脑缙谠\斷可有效提高腫瘤患者的5年生存率及生活質(zhì)量,然而,目前的診斷技術手段靈敏度及特異性較低,不僅費時且通常依賴昂貴的診斷設備。因此,開發(fā)具有高靈敏度、高特異性、省時、經(jīng)濟的新型診斷技術手段是口腔癌診斷過程中需要迫切解決的問題。目前,口腔癌的主要治療手段是以手術治療為主的,包括化學治療、放射治療在內(nèi)的綜合序列治療,然而,傳統(tǒng)治療方式在治療口腔癌的同時往往為患者帶來嚴重的毒副作用以及頜面部容貌缺陷,導致患者沉重的社會心理負擔,影響患者的生活質(zhì)量。因此,也亟待開發(fā)一種治療效果可靠,局部損傷較小的新型治療方式。金納米棒(GNRs)作為一種新興的納米材料,其獨特的表面等離子共振效應(SPR)使其被廣泛用于生物感知、生物成像、藥物運載及光熱治療等生物醫(yī)學領域。同時,金納米棒具有合成簡便、表面功能化技術手段豐富、生物相容性好等優(yōu)點,通過表面多功能化修飾,可以將金納米棒與其他診斷、治療方式相結合,達到診療一體化或聯(lián)合治療的目的。金納米棒由于其優(yōu)異的光學及物理特性,目前已被廣泛用于腫瘤的診斷及治療研究。本研究將通過對金納米棒進行表面修飾,鏈接特異性口腔癌染色劑孟加拉紅(RB)制備納米復合體分別用于口腔癌的高靈敏診斷和快速篩查,同時利用其光動力和光熱特性進行口腔癌的聯(lián)合治療；此外,我們還探究將金納米棒作為基因治療載體用于光熱治療增敏的研究。第一部分基于金納米棒的多功能復合納米材料的制備及其表征檢測目的：金納米棒作為多功能納米材料的優(yōu)勢在于其豐富的表面功能化選擇。在本部分研究中,我們采用可特異性與口腔癌細胞結合的染色劑-孟加拉紅(RB)對金納米棒進行表面修飾,制備孟加拉紅-金納米棒納米復合體(RB-GNRs),用于后續(xù)口腔癌診斷及治療；同時,利用靜電結合方式制備金納米棒-siRNA復合體用于口腔癌光熱-基因聯(lián)合治療。方法：利用晶種介導的方式合成十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)包被的原始金納米棒,并采用逐層包被的方式將聚(烯丙胺鹽酸鹽)(PAH)包被于金納米棒表面形成PAH-GNRs復合體,利用靜電結合的方式鏈接孟加拉紅與PAH-GNRs,從而得到孟加拉紅-金納米棒納米復合體(RB-GNRs) 。利用紫外-可見-近紅外分光光度計、Zeta電勢儀及透射電鏡檢測合成過程中金納米棒的吸收光譜、表面電勢及形態(tài)特征。利用靜電結合方式制備GNRs-siRNA復合體,檢測其Zeta電勢、光熱轉換性能以及形態(tài)特征,并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測GNRs與siRNA最佳復合比例。最后,采用MTT法檢測上述合成的金納米棒復合體的細胞毒性。結果：利用上述方法合成孟加拉紅-金納米棒納米復合體,通過紫外-可見-近紅外分光光度計檢測該復合體吸收光譜顯示RB-GNRs復合體同時具有RB和GNRs的特異性吸收峰,提示形成穩(wěn)定復合體；Zeta電勢檢測結果顯示在GNRs表面修飾過程中可見其表面電荷的變化,進一步證實RB分子成功結合至GNRs表面；透射電鏡結果則顯示RB-GNRs的長寬徑分別為52±4 nm,13±2 nm,比值為4.2,提示該復合體可能具有良好的細胞攝入能力。利用靜電結合的方式將siRNA和GNRs復合,由于siRNA帶有負電荷,Zeta電勢檢測結果可見GNRs表面電勢的翻轉,同時復合體的縱向等離子共振波峰輕微紅移,均提示siRNA結合至GNRs表面；透射電鏡顯示GNRs-siRNA相比于GNRs差異較小。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測GNRs的siRNA最大復合能力,結果顯示制備的GNRs的siRNA最大復合能力為24ug/pM (siRNA:GNRs)。最后,利用MTT法檢測上述復合體的生物相容性,顯示在低濃度下,均無明顯細胞毒性。結論：成功合成具有水溶穩(wěn)定性好、細胞毒性小、且具備較強近紅外光學吸收的RB-GNRs復合體以及GNRs-siRNA復合體,并可滿足后續(xù)口腔癌診斷及治療的研究。光熱轉換性能以及形態(tài)特征,并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測GNRs與siRNA最佳復合比例。最后,采用MTT法檢測上述合成的金納米棒復合體的細胞毒性。第二部分孟加拉紅-金納米棒納米復合體在口腔癌診斷中的應用目的：以第一部分合成的孟加拉紅-金納米棒復合體(RB-GNRs)為診斷平臺,利用孟加拉紅特異性結合口腔癌細胞后導致的金納米棒表面等離子共振(SPR)波峰位移及其在近紅外光吸收的變化實現(xiàn)口腔癌的高靈敏診斷和快速篩查。方法：通過反復凍融的方式獲得口腔癌細胞系Cal-27和正常口腔上皮細胞裂解液,將其加入RB-GNRs溶液中,利用紫外-可見-近紅外分光光度計檢測混合液中RB-GNRs的表面縱向等離子體共振(LSPR)波峰位移,明確RB-GNRs與Cal-27中內(nèi)容物的特異性結合,實現(xiàn)口腔癌的高靈敏度感知；通過將RB-GNRs與培養(yǎng)中的口腔癌細胞Cal-27孵育2小時后,去除上清中RB-GNRs,基于口腔癌細胞對RB-GNRs的特異性攝取,利用自制的近紅外檢測成像系統(tǒng)檢測口腔癌細胞中RB-GNRs對于近紅外光的吸收強弱,通過計算形成熱圖,實現(xiàn)口腔癌的多通道檢測。結果：基于口腔癌細胞裂解液中RB-GNRs的表面等離子體共振感應實驗結果顯示,與口腔癌細胞Cal-27細胞裂解液孵育后,RB-GNRs的LSPR波峰發(fā)生明顯紅移；且2.2×103至30.3×103個細胞/mL的濃度范圍內(nèi),RB-GNRs的LSPR波峰紅移的幅度與細胞數(shù)呈線性正相關,檢測極限可達2000個細胞/mL,顯示出極高敏感性。與正常上皮細胞裂解液孵育后,未見RB-GNRs的LSPR波峰發(fā)生明顯紅移,上述結果顯示RB-GNRs對口腔癌細胞具有高度特異性�？谇话┘毎慕t外吸收成像分析實驗結果顯示,將終濃度為0.45nM的RB-GNRs加入96孔板中,與口腔癌細胞及正常上皮細胞孵育2小時后,口腔癌細胞Cal-27細胞對于近紅外吸收明顯高于正常上皮細胞,且吸收強度與細胞數(shù)量呈線性正相關。結論：RB-GNRs可作為口腔癌特異性感應探針,對口腔癌細胞裂解液進行高靈敏度診斷；同時,利用自制的近紅外吸收成像捕捉RB-GNRs被口腔癌細胞攝取導致的近紅外吸收,并進行成像分析,可以對口腔癌細胞進行多通道快速檢測。本部分研究為口腔癌診斷提供了新型的無創(chuàng)、簡便的診斷方法。紅移的幅度與細胞數(shù)呈線性正相關,檢測極限可達2000個細胞/mL,顯示出極高敏感性。與正常上皮細胞裂解液孵育后,未見RB-GNRs的LSPR波峰發(fā)生明顯紅移,上述結果顯示RB-GNRs對口腔癌細胞具有高度特異性�？谇话┘毎慕t外吸收成像分析實驗結果顯示,將終濃度為0.45nM的RB-GNRs加入96孔板中,與口腔癌細胞及正常上皮細胞孵育2小時后,口腔癌細胞Cal-27細胞對于近紅外吸收明顯高于正常上皮細胞,且吸收強度與細胞數(shù)量呈線性正相關。第三部分孟加拉紅-金納米棒納米復合體介導的光動力-光熱聯(lián)合治療口腔癌目的：孟加拉紅(RB)作為一種經(jīng)典的光敏劑,在532nm激光照射下,可產(chǎn)生活性氧發(fā)揮光動力治療效應;而金納米棒(GNRs)在近紅外光照射下則具有極強的光熱轉換效率,可發(fā)揮光熱治療效應；基于以上兩點,我們推測復合體RB-GNRs可能在復合光照的情況下同時發(fā)揮光動力與光熱治療效應,達到聯(lián)合治療口腔癌的目的。方法：通過自制裝置檢測RB-GNRs在810nnm近紅外激光照射下的光熱轉換效率；利用9,10-蒽基-雙(亞甲基)二丙二酸(ABDA)分解實驗檢測RB-GNRs在532nm激光下通過產(chǎn)生活性氧形成促進ABDA的分解速率；分別證實RB-GNRs的光熱及光動力治療效應。通過MTT、Annexin V/PI雙染試驗檢測RB-GNRs在532nm光照射下對口腔癌細胞Cal-27的細胞毒效應及凋亡誘導能力；同時,采用流式細胞術檢測處理后的口腔癌細胞中ROS的生成,證明RB-GNRs在532nm光照下于口腔癌細胞中產(chǎn)生單氧的能力。通過臺盼藍染色及MTT檢測RB-GNRs在810nnm激光照射下對口腔癌細胞的細胞毒性,利用二甲基苯并蒽(DMBA)誘導的金黃地鼠頰癌模型,通過近紅外熱成像技術,驗證RB-GNRs在810nm光照下的產(chǎn)熱效率。在金黃地鼠頰癌動物模型中,驗證RB-GNRs在復合光照下對于腫瘤的治療效果和作用機制。結果：利用自制光熱檢測裝置發(fā)現(xiàn)RB-GNRs在經(jīng)810nm激光照射后14分鐘可明顯提升溶液溫度,顯示RB-GNRs具有良好的光熱轉換能力；ABDA分解實驗證實RB-GNRs在經(jīng)532nm激光照射后可顯著促進ABDA的分解,結果顯示經(jīng)照射12分鐘后92%的ABDA發(fā)生分解,提示RB-GNRs具有極強的活性氧生成能力；MTT及Annexin V/PI雙染檢測顯示RB-GNRs在532nm照射下可顯示出明顯的細胞毒性和細胞凋亡誘導能力,同時,利用二氫二氯熒光素(DCFH)氧化后熒光反應檢測532nm激光激發(fā)下RB-GNRs促活性氧簇(ROS)生成能力,顯示綠光照射后RB-GNRs可在短時間內(nèi)顯著增加細胞內(nèi)ROS含量。臺盼藍染色及MTT結果顯示RB-GNRs在810nm激光照射可產(chǎn)生明顯的細胞毒性。在金黃地鼠頰癌模型中瘤內(nèi)注射RB-GNRs,進行810nm激光照射后,熱成像檢測顯示腫瘤局部溫度顯著升高,提示RB-GNRs在近紅外激光下良好的光熱轉換效率。最后,通過建立金黃地鼠頰癌模型進一步在體內(nèi)水平上證實了RB-GNRs在復合光照下的良好的抗腫瘤效果。結論：RB-GNRs在532nm激光照射下具有良好的光動力效應,而810nm激光照射下可發(fā)揮優(yōu)越的光熱轉換效能。RB-GNRs在復合光照即532nm和810nm激光照射下可發(fā)揮良好的光動力及光熱治療效應,在金黃地鼠頰癌模型有效抑制腫瘤生長,甚至治愈腫瘤；在口腔癌治療中展示出巨大的臨床應用前景。明顯的細胞毒性和細胞凋亡誘導能力,同時,利用二氫二氯熒光素(DCFH)氧化后熒光反應檢測532nm激光激發(fā)下RB-GNRs促活性氧簇(ROS)生成能力,顯示綠光照射后RB-GNRs可在短時間內(nèi)顯著增加細胞內(nèi)ROS含量。臺盼藍染色及MTT結果顯示RB-GNRs在810nm激光照射可產(chǎn)生明顯的細胞毒性。在金黃地鼠頰癌模型中瘤內(nèi)注射RB-GNRs,進行810nm激光照射后,熱成像檢測顯示腫瘤局部溫度顯著升高,提示RB-GNRs在近紅外激光下良好的光熱轉換效率。最后,通過建立金黃地鼠頰癌模型進一步在體內(nèi)水平上證實了RB-GNRs在復合光照下的良好的抗腫瘤效果。第四部分金納米棒-BAG3 siRNA納米復合體介導的口腔癌光熱治療增敏目的：為進一步提高金納米棒光熱治療效果,消除腫瘤細胞在光熱治療過程中產(chǎn)生的熱抵抗,我們擬采用靜電吸附siRNA的方式,合成GNRs-BAG3 siRNA復合物,利用GNRs作為光熱劑及siRNA載體沉默熱抵抗相關基因-BAG3,增強腫瘤細胞對于GNRs介導的光熱治療的敏感性,以光熱-基因聯(lián)合治療的方式,提升GNRs介導的腫瘤光熱治療效果。方法：利用實時定量PCR及western blots的方法檢測口腔癌細胞Cal-27在經(jīng)GNRs介導的光熱治療后的熱休克相關蛋白的表達；利用熒光顯微鏡及流式細胞術檢測口腔癌細胞Cal-27對GNRs-siRNAFAM復合體的攝取,并利用實時定量PCR及western blots測定GNRs-BAG3 siRNA對光熱治療后Cal-27細胞中BAG3的沉默效率。利用MTT.Annexin V/PI凋亡雙染試驗,以及檢測Cleaved caspase-3的蛋白表達明確GNRs-BAG3 siRNA介導的光熱治療在口腔癌細胞中的效果。建立Cal-27裸鼠移植瘤模型,將GNRs-siRNAFAM注射于腫瘤組織后,利用熒光顯微鏡明確GNRs-siRNAFAM在體內(nèi)腫瘤組織中的攝取。最后,利用裸鼠移植瘤模型驗證GNRs-BAG3 siRNA介導的光熱治療治療口腔癌的有效性；運用免疫組織化學、TUNEL染色技術檢測腫瘤組織中的BAG3的表達及光熱治療后的細胞凋亡比例。結果：實時定量PCR和Western blots檢測結果顯示GNRs介導的光熱治療可誘導腫瘤細胞表達熱休克相關蛋白HSP27、HSP60、HSP70、HSP90和BAG3表達。利用GNRs-siRNAFAM檢測GNRs的運載能力,顯示GNRs可成功將siRNA運載至口腔癌細胞Cal-27；同時,實時定量PCR和Western blots檢測結果顯示GNRs-BAG3 siRNA可有效抑制光熱治療中BAG3的表達升高。MTT及AnnexinV/PI凋亡雙染結果顯示GNR-BAG3 siRNA介導的細胞毒性及細胞凋亡明顯高于單純GNRs。通過建立Cal-27裸鼠移植瘤模型,在體內(nèi)水平分別證實了GNRs-siRNA的分布和腫瘤細胞攝取,并證實GNRs-BAG3 siRNA優(yōu)于單純GNRs的治療效果,并通過免疫組織化學和TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)GNRs-BAG3 siRNA在顯著抑制BAG3的表達升高同時,促進細胞凋亡。結論：GNRs-BAG3 siRNA復合物通過利用GNRs的運載能力實現(xiàn)光熱-基因聯(lián)合治療,通過抑制熱休克反應相關蛋白BAG3的表達升高,提高口腔癌細胞對于光熱治療的敏感性,在降低光照激發(fā)強度的條件下,提升GNRs介導的光熱治療效果。至口腔癌細胞Cal-27；同時,實時定量PCR和Western blots檢測結果顯示GNRs-BAG3 siRNA可有效抑制光熱治療中BAG3的表達升高。MTT及AnnexinV/PI凋亡雙染結果顯示GNR-BAG3 siRNA介導的細胞毒性及細胞凋亡明顯高于單純GNRs。通過建立Cal-27裸鼠移植瘤模型,在體內(nèi)水平分別證實了GNRs-siRNA的分布和腫瘤細胞攝取,并證實GNRs-BAG3 siRNA優(yōu)于單純GNRs的治療效果,并通過免疫組織化學和TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)GNRs-BAG3 siRNA在顯著抑制BAG3的表達升高同時,促進細胞凋亡。基于金納米棒的腫瘤診斷與治療具有廣闊的臨床應用前景,本實驗深入探究了基于金納米棒的多功能納米復合材料在口腔癌診斷與治療中的應用。在口腔癌診斷方面,通過制備孟加拉紅-金納米棒納米復合體,利用其獨特的表面等離子共振效應和近紅外吸收效應實現(xiàn)了口腔癌的高靈敏診斷和多通道篩查；在口腔癌治療方面,利用孟加拉紅—金納米棒在復合光照下的光動力和光熱治療效應,實現(xiàn)對口腔癌的聯(lián)合治療,同時,進一步制備金納米棒-siRNA納米復合體通過基因治療的方式抑制腫瘤細胞的熱抵抗效應,提升金納米棒介導的光熱治療效果�？偠灾�,本研究論文闡述了利用金納米棒作為診斷和治療一體化載體的優(yōu)越特性,及其在口腔癌診斷與治療中的廣闊應用前景。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：TB383.1;O614.123
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本文編號：
2163992
