發(fā)布時(shí)間：2014-10-12 10:43

【摘要】 毛發(fā)酸解法提取氨基酸產(chǎn)生的污水是較難處理的工業(yè)污水之一，然而此類(lèi)污水中又含有很多寶貴的資源。本研究利用高鹽毛發(fā)酸解液污水生產(chǎn)飼用酵母，將污水中的資源轉(zhuǎn)化為菌體蛋白，既回收大量有用物質(zhì)，同時(shí)使污水達(dá)排放標(biāo)準(zhǔn)。首先，研究選用了5種微生物菌體吸附污水中的重金屬離子。結(jié)果冬蟲(chóng)夏草菌對(duì)Cr吸附率最高，達(dá)96.4%，可使重金屬達(dá)排放標(biāo)準(zhǔn)。其次，探索了物理化學(xué)、生物吸附法去除污水中的色素及Cl-。結(jié)果色素可被有效吸附，活性炭對(duì)其吸附率達(dá)66.2%。接著，選取12種飼料生產(chǎn)菌進(jìn)行耐鹽性馴化篩選，結(jié)果產(chǎn)朊假絲酵母能在N含量4.8%(w/v)的污水培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在N含量3.2%(w/v)的污水培養(yǎng)基中形成菌落僅需2d。對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化，結(jié)果為：培養(yǎng)時(shí)間3d，裝液量50mL/250mL三角瓶，初始pH5.5，污水N含量3.2%(w/v)，玉米淀粉(酶解液)11%(w/v)，K2HPO42.0%(w/v)，酵母粉0.9%(w/v)，F(xiàn)eSO40.2%(w/v)，MgSO40.9%(w/v)，CaCO30.2%(w/v)，菌體得率達(dá)4.1%(w/v)，較優(yōu)化前提高了128.7%。發(fā)酵后，污水中N含量降低了23.3%。說(shuō)明產(chǎn)朊假絲酵母利用了污水中的部分營(yíng)養(yǎng)成分，大大降低了飼用產(chǎn)朊假絲酵母的發(fā)酵成本，同時(shí)也減小了污水處理難度。最后，我們另從高鹽環(huán)境中篩選到一株能在污水培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的酵母菌，用分子生物學(xué)方法鑒定為飼用漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)。經(jīng)馴化后該菌能在N含量4.8%(w/v)的污水培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在N含量3.2%(w/v)的污水培養(yǎng)基中形成菌落僅需1d。對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化，結(jié)果為：裝液量50mL/250mL三角瓶，初始pH5.0，種齡4d，培養(yǎng)時(shí)間5d，接種量10%(w/v)，污水N含量3.2%(w/v)，玉米淀粉(酶解液)7%(w/v)，KH2PO41.5%(w/v)，酵母粉0.3%(w/v)，F(xiàn)eSO40.6%(w/v)，MgSO40.5%(w/v)，CaCO30.2%(w/v)，菌體得率達(dá)4.9%(w/v)(相當(dāng)于N含量9.67%(w/v)的高鹽污水可轉(zhuǎn)化成14.7%(w/v)的飼用菌體)，較優(yōu)化前提高了48.5%。發(fā)酵后，毛發(fā)酸解液污水N含量降低了82.3%，達(dá)到了較好的處理效果。 

第 1 章 緒 論

 

1.1 我國(guó)水污染現(xiàn)狀

據(jù)調(diào)查，世界上能喝到安全飲用水的人不到 30%，每天約有 2.5 萬(wàn)人死于與水污染相關(guān)的疾病[1]。預(yù)計(jì)到 2050 年，世界上會(huì)有約 70 億人面臨缺水的問(wèn)題[2]。2011年我國(guó)水資源總量[3]為 23256.7 億 m3，為 1956 年以來(lái)最少的一年。人口數(shù)量的增長(zhǎng)、農(nóng)藥噴灑、工業(yè)廢水的亂排亂放等，造成了淡水資源的加劇短缺。工業(yè)污水為水污染的主要來(lái)源之一[3]，占污水排放總量的 32.3%。但是這只是官方統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，實(shí)際上，其排放量大大超過(guò)此數(shù)值[4]，因?yàn)樵S多企業(yè)工業(yè)污水排放量難以統(tǒng)計(jì)。

 

1.2 氨基酸廠廢水特點(diǎn)

 

氨基酸工業(yè)污水有機(jī)物含量高、氨氮含量高、鹽分高、酸性強(qiáng)，處理難度較大[5-7]。目前，生產(chǎn)氨基酸的企業(yè)大部分用強(qiáng)酸酸解人或動(dòng)物的毛發(fā)，生產(chǎn)氨基酸單體工藝流程見(jiàn)圖 1.1。呂墩氨基酸廠用毛發(fā)酸解法提取氨基酸的污水成分和理化性質(zhì)參見(jiàn)表 1.1、表 1.2。

 

第 2 章 菌體吸附法去除毛發(fā)酸解液污水中重金屬的研究

 

2.1 引言
重金屬毒性大，在環(huán)境中不易被代謝，而且可以通過(guò)食物鏈被生物富集和生物放大[50-52]，一旦未經(jīng)處理排放到自然界中，將極大地破壞生態(tài)系統(tǒng)，嚴(yán)重威脅水生生物的生存和人類(lèi)的健康。本實(shí)驗(yàn)選用啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、根霉(Rhizopus)、毛霉(Mucor)、白地霉(Geotrichum candidum)、冬蟲(chóng)夏草菌(Cordyceps sinensis)這 5 種吸附重金屬能力較強(qiáng)的菌[53-57]，吸附污水中的 Pb、As、Hg、Cd、Cr。由于呂墩氨基酸廠污水中只有 Cr 超過(guò)了污水排放標(biāo)準(zhǔn)，因此，實(shí)驗(yàn)選取 Cr 為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，篩選出重金屬高效吸附菌。

 

2.2 實(shí)驗(yàn)材料

2.2.1 菌種

2.2.1.1 啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CICC 31362

2.2.1.2 冬蟲(chóng)夏草菌(Cordyceps sinensis) CCTCC AF99009

2.2.1.3 根霉(Rhizopus) 湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室
2.2.1.4 毛霉(Mucor) 湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

2.2.1.5 白地霉(Geotrichum candidum) CICC 32260

2.2.2 主要儀器與設(shè)備

 

第 3 章 物理化學(xué)、生物吸附法處理毛發(fā)酸解液污水的研究.....14

3.1 引言.............................................................................14

3.2 實(shí)驗(yàn)材料...................................................................... 14

3.2.1 菌種 ......................................................................... 14

3.2.2 主要儀器與設(shè)備...........................................................14

3.2.3 主要試劑 ................................................................... 15

3.2.4 溶液及培養(yǎng)基.............................................................. 15

3.3 實(shí)驗(yàn)方法........................................................................ 16

3.3.1 色度檢測(cè) .....................................................................16

3.3.2 Cl-檢測(cè).........................................................................16

3.3.3 冬蟲(chóng)夏草菌的制備........................................................ 16

3.3.4 冬蟲(chóng)夏草菌處理毛發(fā)酸解液污水.....................................16

3.3.5 活性炭處理毛發(fā)酸解液污水............................................16

3.3.6 殼聚糖處理毛發(fā)酸解液污水............................................17

3.3.7 聚丙烯酰胺處理毛發(fā)酸解液污水..................................... 17

3.4 結(jié)果與分析.......................................................................17

3.4.1 Cl-標(biāo)準(zhǔn)曲線....................................................................17

3.4.2 冬蟲(chóng)夏草菌處理毛發(fā)酸解液污水效果.................................18

3.4.3 活性炭處理毛發(fā)酸解液污水效果........................................18

3.4.4 殼聚糖處理毛發(fā)酸解液污水效果....................................... 20

3.4.5 聚丙烯酰胺處理毛發(fā)酸解液污水效果..................................20

3.5 結(jié)論................................................................................... 20

第 4 章 利用高鹽毛發(fā)酸解液污水生產(chǎn)飼用產(chǎn)朊假絲酵母的研究......21

4.1 引言.................................................................................... 21

4.2 實(shí)驗(yàn)材料.............................................................................. 21

4.2.1 實(shí)驗(yàn)菌種 ...........................................................................21

4.2.2 主要儀器與設(shè)備................................................................. 22

4.2.3 主要試劑 .......................................................................... 22

4.2.4 溶液及培養(yǎng)基......................................................................23

4.3 實(shí)驗(yàn)方法.............................................................................. 24

4.3.1 玉米淀粉預(yù)處理.................................................................. 24

4.3.2 還原糖檢測(cè)..........................................................................24

4.3.3 菌種篩選 ........................................................................... 24

4.3.4 菌種馴化 ........................................................................... 24

4.3.5 紫外誘變 ............................................................................ 24

4.3.6 種子培養(yǎng) ............................................................................ 25

4.3.7 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定.................................................................... 25

4.3.8 裝液量對(duì)高耐鹽菌株生長(zhǎng)的影響............................................. 25

4.3.9 初始 pH 對(duì)高耐鹽菌株生長(zhǎng)的影響............................................26

4.3.10 培養(yǎng)基成分優(yōu)化................................................................... 26

4.3.11 高耐鹽菌株處理毛發(fā)酸解液污水效果...................................... 26

4.4 結(jié)果與分析................................................................................26

4.4.1 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線...................................................................... 26

4.4.2 菌種篩選結(jié)果.......................................................................... 27

4.4.3 菌種馴化結(jié)果........................................................................... 27

4.4.4 紫外誘變結(jié)果........................................................................... 27

4.4.5 產(chǎn)朊假絲酵母生長(zhǎng)曲線的測(cè)定.................................................... 29

4.4.6 裝液量對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母生長(zhǎng)的影響...............................................29

4.4.7 初始 pH 對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母生長(zhǎng)的影響........................................... 30

4.4.8 培養(yǎng)基成分優(yōu)化......................................................................... 30 

4.4.9 產(chǎn)朊假絲酵母處理毛發(fā)酸解液污水效果........................................ 36

4.5 結(jié)論..............................................................................................37

第 5 章 利用高鹽毛發(fā)酸解液污水生產(chǎn)飼用漢遜德巴利酵母的研究............38

5.1 引言............................................................................................. 38

5.2 實(shí)驗(yàn)材料...................................................................................... 38

5.2.1 實(shí)驗(yàn)菌種 ....................................................................................38

5.2.2 主要儀器與設(shè)備.......................................................................... 38

5.2.3 主要試劑 ................................................................................... 39

5.2.4 引物 .......................................................................................... 40

5.2.5 溶液及培養(yǎng)基.............................................................................. 40

5.3 實(shí)驗(yàn)方法........................................................................................ 41

5.3.1 玉米淀粉預(yù)處理........................................................................... 41

5.3.2 還原糖檢測(cè).................................................................................. 41

5.3.3 菌種篩選..................................................................................... 41

5.3.4 菌種馴化 ......................................................................................41

5.3.5 高耐鹽酵母菌的分子生物學(xué)鑒定..................................................... 41

5.3.6 種子培養(yǎng) ..................................................................................... 43

5.3.7 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定............................................................................. 43

5.3.8 裝液量對(duì)耐鹽酵母菌生長(zhǎng)的影響.......................................................44

5.3.9 初始 pH 對(duì)耐鹽酵母菌生長(zhǎng)的影響................................................... 44

5.3.10 種齡、搖瓶發(fā)酵時(shí)間及接種量的優(yōu)化.............................................. 44

5.3.11 培養(yǎng)基成分優(yōu)化............................................................................ 44

5.4 結(jié)果與討論........................................................................................ 45

5.4.1 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制........................................................................ 45

5.4.2 篩選馴化結(jié)果.................................................................................. 45

5.4.3 分子鑒定結(jié)果................................................................................... 46

5.4.4 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定................................................................................ 52

5.4.5 裝液量對(duì)漢遜德巴利酵母生長(zhǎng)的影響................................................... 52

5.4.6 初始 pH 對(duì)漢遜德巴利酵母生長(zhǎng)的影響................................................ 52 

5.4.7 種齡、搖瓶發(fā)酵時(shí)間及接種量正交試驗(yàn)結(jié)果......................................... 53

5.4.8 培養(yǎng)基成分優(yōu)化................................................................................. 54

5.4.9 漢遜德巴利酵母處理毛發(fā)酸解液污水效果............................................. 55

5.5 結(jié)論..................................................................................................... 56

 

第 5 章 利用高鹽毛發(fā)酸解液污水生產(chǎn)飼用漢遜德巴利酵母的研究

 

5.1 引言

采集高鹽環(huán)境的水樣、土樣，培養(yǎng)于高濃度毛發(fā)酸解液污水培養(yǎng)基中，以期篩選出對(duì)高鹽污水具有高耐受力的優(yōu)勢(shì)飼用酵母菌株，將氨基酸轉(zhuǎn)化為菌體蛋白，降低污水中的 N 含量，凈化污水的同時(shí)，做到廢物回收再利用。本章從高鹽環(huán)境中篩選出的酵母菌, 再通過(guò)連續(xù)馴化培養(yǎng)進(jìn)一步提高其耐鹽能力，獲得一株高耐鹽酵母菌。運(yùn)用了分子生物學(xué)方法，檢測(cè)與分析從高鹽環(huán)境中篩選出的酵母菌的 18SrDNA、26S rDNA 及 ITS 序列，鑒定其為可飼用的漢遜德巴利酵母，隨后探索其最優(yōu)生長(zhǎng)條件，大幅提高其了對(duì)污水中氮源的利用能力。

 

5.2 實(shí)驗(yàn)材料

5.2.1 實(shí)驗(yàn)菌種大腸桿菌 Top 10 湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

 

第 6 章 結(jié)論及展望

 

6.1 結(jié)論

⑴ 研究用 5 種微生物菌體吸附毛發(fā)酸解液污水中的微量重金屬離子。結(jié)果冬蟲(chóng)夏草菌對(duì) Cr 吸附率最高，達(dá) 96.4%，可使重金屬達(dá)排放標(biāo)準(zhǔn)。⑵ 探究物理化學(xué)、生物吸附法去除污水中的色素及 Cl-。結(jié)果冬蟲(chóng)夏草菌、活性炭、聚丙烯酰胺及殼聚糖均不能有效去除高濃度 Cl-；活性炭吸附色素的效果較好，吸附率達(dá) 66.2%。⑶ 選取 12 種飼料生產(chǎn)菌進(jìn)行耐鹽性馴化篩選，結(jié)果產(chǎn)朊假絲酵母能夠在 N含量為 4.8% (w/v)的污水培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在 N 含量為 3.2% (w/v)的污水培養(yǎng)基中 2d 即可長(zhǎng)出菌落。對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果為：培養(yǎng)時(shí)間 3 d，裝液量 50 mL/250 mL 三角瓶，初始 pH5.5，污水 N 含量 3.2% (w/v)，玉米淀粉(酶解液)11% (w/v)，K2HPO42.0% (w/v)，酵母粉 0.9% (w/v) ，F(xiàn)eSO40.2% (w/v)，MgSO40.9% (w/v)，CaCO30.2% (w/v)。在此條件下，菌體得率可達(dá) 4.1% (w/v)，較優(yōu)化前提高了 128.7%。經(jīng)產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵后，污水 N 含量降低了 23.3%；添加的 11%(w/v)玉米淀粉酶解液經(jīng)微生物部分吸收，部分分解后，上清還原糖仍有 3.78%(w/v)。⑷ 進(jìn)一步從高鹽環(huán)境中篩選鑒定到一株能在高濃度污水培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的漢遜德巴利酵母。經(jīng)馴化，該菌能在 N 含量為 4.8% (w/v)的污水培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在 N含量為 3.2% (w/v)的污水培養(yǎng)基中長(zhǎng)出菌落僅需 1 d。其培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果為：培養(yǎng)時(shí)間 5 d，裝液量 50 mL/250 mL 三角瓶，初始 pH5.0，種齡 4 d，接種量 10% (w/v)，污水 N 含量 3.2% (w/v)，玉米淀粉酶解液 7% (w/v)，KH2PO41.5% (w/v)，酵母粉0.3% (w/v)，F(xiàn)eSO40.6% (w/v)，MgSO40.5% (w/v)，CaCO30.2% (w/v)。在此條件下，菌體得率可達(dá) 4.9% (w/v)，較優(yōu)化前提高了 48.5%。經(jīng)發(fā)酵后，污水中的含 N量降低了 82.3%；還原糖殘留量 3.09% (w/v)。同產(chǎn)朊假絲酵母相比，漢遜德巴利酵母培養(yǎng)基中添加的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更少，成本更低，而且對(duì)污水中的 N 源利用率更高，處理效果更好。

 

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