發(fā)布時(shí)間：2020-11-09 13:02

　　 超低溫保存被認(rèn)為是目前最理想的植物種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存的方法。在諸多研究中發(fā)現(xiàn),不同實(shí)驗(yàn)室用同樣的方法保存同一基因型時(shí)再生率有很大差異。探明導(dǎo)致這種情況發(fā)生的原因無(wú)疑將有利于不同實(shí)驗(yàn)室超低溫基因庫(kù)的建立。病毒病害是制約蘋(píng)果生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的主要因素之一,無(wú)毒苗的培育是生產(chǎn)上防止病毒病害的核心技術(shù)。蘋(píng)果莖痘病毒(apple stem grooving virus,ASGV)是一種難以脫除的病毒,建立該病毒的高效脫毒新技術(shù)有利于蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。帶毒材料是病毒基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究的前提條件。病毒是專(zhuān)性病原體,必須依賴(lài)寄主才能復(fù)制與增殖。因此,病毒的長(zhǎng)期保存十分困難。建立病毒高效、安全、長(zhǎng)期的保存技術(shù)可為病毒的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究提供病原材料。本研究旨在:(1)比較蘋(píng)果帶毒(ASGV)莖尖與無(wú)毒莖尖超低溫保存后再生的差異,并探討病毒導(dǎo)致莖尖超低溫保存后再生力低的原因;(2)建立熱處理結(jié)合莖尖超低溫療法高效脫除ASGV的技術(shù),并揭示其脫毒機(jī)理;(3)建立莖尖超低溫保存ASGV的技術(shù),并證明該技術(shù)保存病毒的有效性。本研究獲得的主要研究成果如下:1.以蘋(píng)果‘Gala’單感ASGV和無(wú)毒試管苗為試材,用小滴玻璃化(droplet-vitrification)保存莖尖。結(jié)果表明,帶毒莖尖與無(wú)毒莖尖的成活率和再生率均沒(méi)有明顯差異。但無(wú)毒莖尖的再生速度快于帶毒莖尖,且均再生正常的莖。帶毒莖尖表現(xiàn)出三種再生類(lèi)型:正常莖、蓮座莖和蓮座莖帶不正常葉片,三種再生類(lèi)型的比例分別為45%,32%和23%。ASGV帶毒苗和無(wú)毒苗在繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周后,帶毒苗形成的莖數(shù)/株為7.2,明顯高于無(wú)毒苗(5.1)。無(wú)毒苗形成的≥1.0 cm和1.0 cm但≥0.5 cm的莖數(shù)為2.9和2.2,且沒(méi)有0.5 cm的莖。帶毒苗形成的≥1.0 cm、1.0 cm但≥0.5cm和0.5 cm的莖數(shù)分別為1.8、2.8和2.6,分別占總莖數(shù)的25%、38.9%和36.1%。無(wú)毒苗的生長(zhǎng)素(IAA)和玉米素(ZR)含量分別為15.9和14.3μg/g,明顯高于帶毒苗(12.4μg/g和11.2μg/g)。帶毒苗的可溶性糖、可溶性總蛋白和脯氨酸水平分別為11.1 mg/g、8.7 mg/g和17.2μg/g,分別比無(wú)毒苗高16%、30%和28%。無(wú)毒苗的電解質(zhì)滲出率為8.1%,明顯低于帶毒苗(9.8%)。組織切片對(duì)超低溫保存后成活細(xì)胞在莖尖的分布結(jié)果表明:無(wú)毒莖尖的成活細(xì)胞分布在頂端分生組織1-8層和第1-4葉原基,成活細(xì)胞的比例分別為62%和34%。而帶毒莖尖的成活細(xì)胞分布在頂端分生組織1-5層和第1-4葉原基,成活比例分別為46%和30%。細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)研究表明:無(wú)毒莖尖和帶毒莖尖的超微結(jié)構(gòu)大致相似,唯有線(xiàn)粒體形態(tài)有所不同:無(wú)毒莖尖細(xì)胞的線(xiàn)粒體為卵形(正常),而帶毒莖尖細(xì)胞的線(xiàn)粒體明顯加長(zhǎng)。帶毒試管苗生長(zhǎng)素和玉米素的降低可能導(dǎo)致試管苗莖數(shù)量的增加和長(zhǎng)度降低。病毒引起的細(xì)胞膜傷害(電解質(zhì)滲出率上升)和線(xiàn)粒體超微結(jié)構(gòu)的變化可能降低細(xì)胞對(duì)超低溫的抗性,進(jìn)而導(dǎo)致再生正常莖的能力降低。2.以單感ASGV的蘋(píng)果‘Gala’試管苗為試材,成功建立了熱處理結(jié)合小滴玻璃化法莖尖超低溫療法脫除ASGV的技術(shù)。將帶毒試管苗置于36 ~o C/32 ~o C(白天/夜間)光照條件下熱處理4周,從熱處理后的試管苗上取1.5 mm(帶3-4葉原基)的莖尖,經(jīng)小滴玻璃化超低溫處理或莖尖培養(yǎng),獲得再生試管苗。待試管苗移入溫室生長(zhǎng)10個(gè)月后,用RT-PCR檢查植株的帶毒情況。結(jié)果表明,熱處理不會(huì)影響帶毒試管苗的成活,但明顯影響試管苗的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng):熱處理后植株莖的長(zhǎng)度為2.5 cm,顯著低于對(duì)照(3.5 cm);但增殖率(4.7)明顯高于對(duì)照(2.5)。超低溫療法后的莖尖再生率隨熱處理周數(shù)的延長(zhǎng)而明顯下降,但脫毒率明顯上升。熱處理4周的脫毒率為100%。熱處理后莖尖培養(yǎng)的再生率(78%)高于超低溫療法(44%),但前者的脫毒率(26%)明顯低于后者(100%)。熱處理結(jié)合莖尖超低溫療法分別得到了100%(‘Fuji’)、40%(‘濃果25’)、30%(‘瑞雪’)和83%(‘M9’)的脫毒率。免疫組織化學(xué)法對(duì)ASGV在‘Gala’和‘瑞雪’莖尖的定位表明:ASGV可感染兩個(gè)蘋(píng)果品種的頂端分生組織和幼嫩葉原基。隨著熱處理周數(shù)的增加,莖尖頂端分生組織的無(wú)毒區(qū)明顯擴(kuò)大。熱處理4周后,‘Gala’莖尖的分生組織和第1-5片葉原基不能定位到病毒,而‘瑞雪’莖尖的第4葉原基中能明顯定位到病毒。超低溫療法處理后,‘Gala’和‘瑞雪’的莖尖頂端分生組織和第1-3片葉原基中有大量細(xì)胞成活,但‘Gala’在第4葉原基中僅有少量細(xì)胞成活,而‘瑞雪’的第四片葉原基中有較多細(xì)胞成活。病毒在不同基因型莖尖中分布的不同和超低溫處理后的莖尖細(xì)胞成活模式的差異解釋了不同基因型中存在脫毒率差異的原因。3,以單感ASGV的蘋(píng)果‘Gala’試管苗為試材,用小滴玻璃化法(droplet-vitrification)和包埋干燥法(encapsulation-dehydration)分別處理莖尖,獲得62-67%的再生率。再生試管苗經(jīng)RT-PCR檢測(cè),兩種莖尖超低溫方法所獲得的再生苗ASGV帶毒率均為100%。與帶毒試管苗(對(duì)照)比較,超低溫保存后帶毒苗繼代培養(yǎng)8周后的增殖率和病毒濃度明顯低于對(duì)照,但繼代培養(yǎng)16周后的增殖與病毒濃度與對(duì)照相似。使用試管苗微型嫁接技術(shù)將超低溫保存后的帶毒苗嫁接在蘋(píng)果‘Gala’無(wú)毒試管苗上,嫁接21天后的傳毒率為100%。將超低溫保存后的病毒使用摩擦接種技術(shù)侵染煙草葉片,接種21天后,明顯觀察到煙草葉片上的病毒癥狀。應(yīng)用RT-PCR法在顯示癥狀的葉片中檢測(cè)到了病毒。對(duì)超低溫保存的ASGV病毒的三個(gè)基因片段(包括編碼外殼蛋白和運(yùn)動(dòng)蛋白)的測(cè)序結(jié)果表明,超低溫保存后的ASGV與對(duì)照ASGV基因序列的相似性為99.87%。本研究獲得的結(jié)果為使用無(wú)毒材料超低溫保存植物種質(zhì)資源提供了理論依據(jù)。熱處理結(jié)合莖尖超低溫療法為脫除難脫除的植物病毒提供了新的技術(shù)。莖尖超低溫病毒保存技術(shù)為植物病毒的安全、長(zhǎng)期、高效保存開(kāi)辟了新的途徑。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：S436.611.1
【部分圖文】：

圖 1-1 本研究中的技術(shù)路線(xiàn)圖Figure 1-1 Research technique route of this study在 ASGV 感染影響蘋(píng)果試管苗莖尖超低溫保存的研究中對(duì)無(wú)毒和感染 ASGV 的苗‘Gala’莖尖超低溫保存后莖尖的再生以及試管苗的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)情況進(jìn)行研究研究中獲得的差異，采用組織學(xué)觀察對(duì)超低溫保存后莖尖中的細(xì)胞成活情況進(jìn)行，并對(duì)試管苗莖尖的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，此外還對(duì)試管苗的內(nèi)源激素水平和代謝物進(jìn)行測(cè)定。在熱處理結(jié)合超低溫冷凍脫除 ASGV 病毒的研究中使用感染 ASGV 的‘Gala’苗為材料對(duì)脫毒體系中不同的熱處理時(shí)間和所取的莖尖大小進(jìn)行優(yōu)化，將優(yōu)化好毒體系應(yīng)用在其它 4 個(gè)蘋(píng)果基因型中進(jìn)行廣譜性測(cè)定。最后選用兩種再生率和脫差異較大的基因型，使用免疫組織化學(xué)病毒定位和組織學(xué)細(xì)胞染色的手段對(duì)不同熱處理后的莖尖病毒分布情況和冷凍后的細(xì)胞成活情況進(jìn)行觀察，從而揭示獲得脫毒結(jié)果的機(jī)理。

的第二層和第五層成活細(xì)胞進(jìn)行觀察。數(shù)據(jù)分析管苗營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和冷凍保存后的再生情況的研究采用包含 10 個(gè)樣本，每次試驗(yàn)包含 3 個(gè)重復(fù)，所有試驗(yàn)標(biāo)測(cè)定試驗(yàn)中，每個(gè)指標(biāo)測(cè)定選取 5 個(gè)生物學(xué)重復(fù)保存后的組織成活研究，每個(gè)處理選取 30 個(gè)芽進(jìn)行生組織細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)研究，每個(gè)處理選取 10 個(gè)芽析結(jié)合 Student’s t-test 在 P<0.05 檢驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證其差異均值表示。株內(nèi)的檢測(cè)R 檢測(cè)，嫁接傳毒后的無(wú)毒材料中檢測(cè)出了 524 bp 擴(kuò)增出任何 PCR 條帶。ASGV 的帶毒苗莖尖經(jīng)超低否正常，3 個(gè)月后都可在再生植株中檢出 ASGV 病

西北農(nóng)林科技大學(xué)博士學(xué)位論文.3.2 ASGV 感染對(duì)于超低溫保存后的蘋(píng)果莖尖的再生影響ASGV 感染的蘋(píng)果莖尖超低溫保存成活率與無(wú)毒植株莖尖超低溫保存后的成活相似，但無(wú)毒的莖尖經(jīng)冷凍保存后的再生速度明顯快于帶毒莖尖（圖 2-2c,d）。無(wú)莖尖超低溫保存結(jié)束后在 1 個(gè)月的時(shí)間內(nèi)可以完成再生。經(jīng)過(guò) 8 周再生后，超低溫存的無(wú)毒與帶毒莖尖的再生率沒(méi)有顯著性差異，但無(wú)毒苗的莖尖在再生過(guò)程中始終持正常的形態(tài)并可以進(jìn)行后續(xù)的繼代擴(kuò)繁（圖 2-2e，表 2-3）。然而，感染 ASGV毒的試管苗在再生過(guò)程中只有 45%表現(xiàn)正常形態(tài)，其余的占 32%的莖尖在再生過(guò)程表現(xiàn)蓮座狀帶正常葉片的形態(tài)（圖 2-2f，表 2-3）此外還有 23%的莖尖再生過(guò)程中現(xiàn)蓮座狀再生帶不正常形態(tài)的葉片 (圖 2-2g，表 2-3)。不正常的再生的莖尖無(wú)法在續(xù)繼代過(guò)程中正常的增殖。
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