發(fā)布時(shí)間：2020-11-07 13:31

　　 巴西橡膠樹(shù)(Hevea brasiliensis)屬于大戟科橡膠樹(shù)屬,是一種多年生熱帶喬木。天然橡膠的主要來(lái)源是從橡膠樹(shù)中產(chǎn)生的膠乳,具有十分重要的商業(yè)利用價(jià)值。前人已先后利用不同的分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了巴西橡膠樹(shù)的多張遺傳圖譜,但是遺傳圖譜與染色體之間的關(guān)系尚不明確。將物理圖譜和遺傳圖譜整合,構(gòu)建分子細(xì)胞遺傳學(xué)圖譜,對(duì)于基因組序列的正確組裝,序列拼接具有重要意義。本研究以巴西橡膠樹(shù)熱研7-33-97品種為材料,利用熒光原位雜交與原位PCR技術(shù),選取Lespinasse等構(gòu)建的橡膠樹(shù)遺傳圖譜第6號(hào)和第16號(hào)連鎖群上的16個(gè)RFLP標(biāo)記,將這些標(biāo)記定位到巴西橡膠樹(shù)的染色體上,通過(guò)核型分析,從而確定這些標(biāo)記在染色體的位置,以及連鎖群和染色體的對(duì)應(yīng)關(guān)系。研究結(jié)果如下:(1)來(lái)自第6號(hào)連鎖群上的13個(gè)遺傳標(biāo)記被定位到了巴西橡膠樹(shù)熱研7-33-97的第3號(hào)染色體上,遺傳圖譜中連鎖群上遺傳標(biāo)記排列順序和在染色體上的位置順序是一致的。其中 gHbCIR477、gHbCIR689.L1、gHbCIR140、gHbCIR207、gHbCIR 121、gHbCIR523.L1、gHbCIR150、gHbCIR 528這8個(gè)遺傳標(biāo)記在3號(hào)染色體的短臂上,信號(hào)位點(diǎn)到著絲粒的百分距離依次為56.55、37.59、33.16、28.78、21.51、17.79、15.67和 4.63,而 gHbCIR475、gHbCIR129/489、gHbCIR647.L1、gHbCIR396、gHbCIR675這5個(gè)遺傳標(biāo)記在3號(hào)染色體長(zhǎng)臂上,信號(hào)位點(diǎn)到著絲粒的百分距離依次為28.02、30.96、51.04、53.69、66.34,著絲粒的位置在遺傳標(biāo)記gHbCIR528與遺傳標(biāo)記gHbCIR475 之間。(2)來(lái)自第16號(hào)連鎖群上的6個(gè)遺傳標(biāo)記(gHbCIR421、gHbCIR588、gHbCIR647.L2、gHbCIR130、gHbCIR523.L2 和 gHbCIR689.L2)被定位到了巴西橡膠樹(shù)熱研7-33-97的第15號(hào)染色體上,并且遺傳圖譜中連鎖群上遺傳標(biāo)記排列順序和在染色體上的位置順序是一致的。其中g(shù)HbCIR421、gHbCIR588、gHbCIR647.L2和gHbCIR130標(biāo)記在15號(hào)染色體的短臂上,信號(hào)位點(diǎn)到著絲粒的百分距離依次為27.96、18.98、15.40 和 12.56,而 gHbCIR523.L2 和 gHbCIR689.L2 遺傳標(biāo)記在 15 號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上,信號(hào)位點(diǎn)到著絲粒的百分距為43.13和60.50,著絲粒的位置在遺傳標(biāo)記gHbCIR130與遺傳標(biāo)記gHbCIR523.L2之間。(3)通過(guò)第6號(hào)和第16號(hào)連鎖群的定位結(jié)果,我們可以初步判定:Lespinasse等構(gòu)建的遺傳圖譜上第6號(hào)連鎖群與巴西橡膠樹(shù)熱研7-33-97的第3號(hào)染色體對(duì)應(yīng);第16號(hào)連鎖群與巴西橡膠樹(shù)熱研7-33-97的第15號(hào)染色體對(duì)應(yīng)。
【學(xué)位單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類(lèi)】：S794.1
【部分圖文】：

按照前述ＤＮＡ全基因組的提取方法，總共進(jìn)行了?４個(gè)重復(fù)巴西橡膠樹(shù)７－３３－９７??基因組?ＤＮＡ?的提取，以？ｉ－Ｈｉｎｄｌｌｌ?ｄｉｇｅｓｔ（ＴａＫａＲａ）為參照、以?５叫與?２ｐＬ６ｘｌｏａｄｉｎｇ??ｂｕｆｆｅｒ混合進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，圖１中條帶單一清晰、無(wú)明顯拖尾與降解且分子量均??大于２３．１３ｋｂ說(shuō)明提取的基因組ＤＮＡ完整。再進(jìn)一步將提取的ＤＮＡ用紫外分光光度??計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，得到的濃度均為２００－４００ｎｇ／ｐＬ，?ＯＤ２６０／２８０的值均在１．６－１．８之間，說(shuō)??明提取的ＤＮＡ濃度和純度都符合實(shí)驗(yàn)所需要求。??１３０ｂｐ—??■??圖１熱研７－３３－９７品種葉片基因組ＤＮＡ的１０個(gè)重復(fù)圖??Ｆｉｇ．ｌ?Ｔｅｎ?ｇｅｎｏｍｉｃ?ＤＮＡ?ｏｆ?Ｌｅａｖｅｓ?ｏｆ?７－３３－９７??３．２?１６個(gè)遺傳標(biāo)記特異性序列擴(kuò)增與序列比對(duì)結(jié)果??將設(shè)計(jì)的引物通過(guò)以提取的基因組ＤＮＡ為模板并按照ＰＣＲ反應(yīng)體系與條件（參照??２．２．３．２）進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，經(jīng)擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖２，目的產(chǎn)物為單一??條帶，且大小與設(shè)計(jì)引物時(shí)擴(kuò)增目標(biāo)片段一致。將擴(kuò)增出的ＰＣＲ產(chǎn)物進(jìn)行膠回收和試劑??盒純化，為了進(jìn)一步驗(yàn)證擴(kuò)增的ＤＮＡ片段為我們所要的目的片段，將回收得到產(chǎn)物送由??上海英俊公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序后的序列進(jìn)行拼接，將拼接的序列與我們目的序列在??ＮＣＢＩ進(jìn)行Ｂｌａｓｔ比對(duì)，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表５和附圖１－１６。，通過(guò)表５，擴(kuò)增得到的ＰＣＲ與目??的序列的相似都均在９０％以上，比對(duì)結(jié)果吻合，說(shuō)明擴(kuò)增出的ＤＮＡ片段就是我們所要??的目的片段

Ｆｉｇ．２?Ｓｐｅｃｉｆｉｃ?ｐｒｉｍｅｒｓ?ｗｅｒｅ?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｂｙ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｎ?ｇｅｎｏｍｉｃ?ＤＮＡ?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｐｒｏｄｕｃｔｓ?ａｔ?Ｒｅｙａｎ?３－３３－９７??（圖中閱，１－１６分別對(duì)應(yīng)２００卜卩０１＼八１３（１（１６獷１＼１３１＾１＊（�。常保蓿蓿�、邑《＾（：１１＾４７７、廷１１１）＜：１１１１ｂＣＩＲ２０７、ｇＨｂＣＩＲ１２１、ｇＨｂＣＩＲ５２３．Ｌｌ／?ｇＨｂＣＩＲ５２３．Ｌ２?．?ｇＨｂＣＩＲ１５０、ｇＨｂＣＩＲ５２８ｂＣＩＲ４７５、ｇＨｂＣＩＲ１２９／４８９、ｇＨｂＣｌＲ３９６、ｇＨｂＣＩＲ６７５、ｇＨｂＣＩＲ６４７．Ｌｌ／?ｇＨｂＣＩＲ６４７．ＬｂＣＩＲ６８９．Ｌｌ／ｇＨｂＣＩＲ６８９．Ｌ２、ｇＨｂＣＩＲ５８８、ｇＨｂＣＩＲ４２１、ｇＨｂＣＩＲ１３０）??（Ｉｎ?ｔｈｅ?ｆｉｇｕｒｅ，Ｍ，?１－１６?ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄ?２００ｂｐ?ＤＮＡ?ｌａｄｄｅｒ?Ｍａｋｅｒ?（Ｔａｋａｒａ）、ｇＨｂＣＩＲ４７ｂＣＩＲ１４０、ｇＨｂＣＩＲ２０７、ｇＨｂＣＩＲ１２１、ｇＨｂＣＩＲ５２３丄?１／?ｇＨｂＣＩＲ５２３．Ｌ２、ｇＨｂＣＩＲ１５０ｂＣＩＲ５２８、ｇＨｂＣＩＲ４７５、ｇＨｂＣＩＲｌ２９／４８９、ｇＨｂＣＩＲ３９６、ｇＨｂＣＩＲ６７５、ｇＨｂＣＩＲ６４７ｂＣＩＲ６４７．Ｌ２、?ｇＨｂＣＩＲ６８９．Ｌｌ／?ｇＨｂＣＩＲ６８９丄?２、?ｇＨｂＣＩＲ５８８、?ｇＨｂＣＩＲ４２１ｂＣＩＲ１３０ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）??表６測(cè)序序列與目的序列比對(duì)結(jié)果??Ｔａｂｌｅ?６?Ｃｏｍｐａｒｅ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ａｎｄ?ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ?ｓ

３．３．１?ｇＨｂＣＩＲ４７７遺傳標(biāo)記的物理定位??用ｇＨｂＣＩＲ４７７的特異ＤＮＡ序列標(biāo)記為ＤＩＧ標(biāo)記的探針進(jìn)行ＦＩＳＨ檢測(cè)分析，得??到如圖３的結(jié)果，通過(guò)圖３可知在染色體分裂的不同時(shí)期均能檢測(cè)到２個(gè)信號(hào)位點(diǎn)，??根據(jù)Ｓｏｎｇ?Ｙ等１９９５年報(bào)道的信號(hào)位點(diǎn)的百分距離的計(jì)算方法，結(jié)合高和瓊等（２００９）??的核型分析數(shù)據(jù)進(jìn)行核型結(jié)合分析，得到圖３－Ａ５的核型圖。ｇＨｂＣＩＲ４４７遺傳標(biāo)記位??于第３號(hào)染色體的短臂上，信號(hào)位點(diǎn)到著絲粒的百分距離為５６．５５：???ＨＵ??圖３?ＤＩＧ標(biāo)記的ｇＨｂＣＩＲ４７７遺傳標(biāo)記在巴西橡膠樹(shù)熱研７－３３－９７有絲分裂各個(gè)時(shí)期的鏡檢??圖（Ａ１：間期；Ａ２：前期；Ａ３：中期；Ａ４：陰性對(duì)照；Ａ５：中期細(xì)胞核型圖）??Ｆｉｇ．３?Ｇｅｎｅｔｉｃ?ｍａｒｋｅｒｓ?ｏｆ?ｇＨｂＣＩＲ４７７?ｍａｒｋｅｄ?ｂｙ?ＤＩＧ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ?ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｖａｒｉｏｕｓ??ｐｅｒｉｏｄｓ?ｏｆ?ｍｉｔｏｓｉｓ?ｏｆ?Ｒｅｙａｎ?７－３３－９７?ｏｆ?Ｈｅｖｅａ?ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ?（Ａｌ：Ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ?ｃｅｌｌ；?Ａ２：Ｐｒｏｍｅｔａｐｈａｓｅ?ｃｅｌｌ；??Ａ３：Ｍｅｔａｐｈａｓｅ?ｃｅｌｌ；Ａ４：?ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ；?Ａ５：?ｋａｒｙｏｔｙｐｅ?ｏｆ?Ｍｅｔａｐｈａｓｅ?ｃｅｌｌ）??３．３．２?ｇＨｂＣＩＲ１４０遺傳標(biāo)記的物理定位??用ｇＨｂＣＩＲ１４０的特異ＤＮＡ序列標(biāo)記為ＤＩＧ標(biāo)記的探針進(jìn)行ＦＩＳＨ檢測(cè)分析，得??到如圖４的結(jié)果
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2874017