發(fā)布時(shí)間：2020-12-15 19:02

　　衰老是植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要生命過(guò)程,通過(guò)衰老的發(fā)生,植物可以自我保護(hù)和抵抗不良外界環(huán)境。衰老的調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜,而早衰突變體的發(fā)現(xiàn)為人們研究衰老的機(jī)制提供了理想的工具。本實(shí)驗(yàn)室在研究白樺（Betula platyphylla×B.pendula）BpGH3.5基因時(shí),獲得了 21個(gè)超表達(dá)株系,其中有一個(gè)株系葉片表面逐漸長(zhǎng)有褐色的斑點(diǎn),葉片提前脫落,表現(xiàn)為早衰的表型,命名為lmd（Lesion mimic and defoliation）株系。選取突變株系lmd、轉(zhuǎn)基因?qū)φ誈21株系、野生型對(duì)照WT株系進(jìn)行了植株生長(zhǎng)、光合生理、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、組織化學(xué)染色、相關(guān)酶類(lèi)活性變化、抗病性等方面的研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,lmd株系的株高、地徑和凈光合速率均顯著低于兩個(gè)對(duì)照株系,而其他的光合指標(biāo)和葉綠素?zé)晒鈪��?shù)與兩個(gè)對(duì)照株系相比并無(wú)顯著差別。實(shí)體顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)lmd株系第4葉開(kāi)始,葉片表面出現(xiàn)褐色斑點(diǎn),并且斑點(diǎn)的數(shù)目隨著葉齡的增加而逐漸增加,但其大小并未發(fā)生改變。石蠟切片結(jié)果表明褐色斑點(diǎn)處的細(xì)胞已經(jīng)死亡,Evans blue染色結(jié)果表明lmd株系葉片死亡細(xì)胞數(shù)目顯著多于兩個(gè)對(duì)照。細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)lmd株系... 

【文章來(lái)源】：東北林業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：117 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 緒論
    1.1 影響植物葉片衰老的因素
        1.1.1 葉片衰老的外部因素
        1.1.2 葉片衰老的內(nèi)部因素
    1.2 植物衰老的生理生化變化
    1.3 植物衰老的分子機(jī)理
        1.3.1 葉片衰老的多水平調(diào)控
        1.3.2 植物衰老相關(guān)基因
    1.4 EIN3/EILs轉(zhuǎn)錄因子家族研究進(jìn)展
        1.4.1 EIN3/EILs參與乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
        1.4.2 EIN3/EILs與植物的抗逆性有關(guān)
        1.4.3 EIN3/EILs調(diào)節(jié)乙烯與其它激素的交叉對(duì)話
    1.5 本研究的目的與意義
2 白樺早衰突變體的特征
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 供試菌種
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要儀器設(shè)備
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 株高和地徑的調(diào)查
        2.2.2 光合速率和葉綠素?zé)晒鈪��?shù)的測(cè)定
        2.2.3 葉片表面超微結(jié)構(gòu)的觀察
        2.2.4 石蠟切片的制備與觀察
        2.2.5 葉片超微結(jié)構(gòu)的觀察
        2.2.6 組織化學(xué)染色
        2.2.7 POD、SOD及MDA的測(cè)定
        2.2.8 抗病性觀察
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 lmd、G21、WT株系生長(zhǎng)性狀比較
        2.3.2 lmd、G21、WT株系光合特性和葉綠素?zé)晒鈪��?shù)比較
        2.3.3 lwd、G21、WT株系葉片表面超微結(jié)構(gòu)觀察
        2.3.4 lmd、G21、WT株系葉片組織解剖結(jié)構(gòu)的觀察
        2.3.5 lmd、G21、WT株系葉片超微結(jié)構(gòu)觀察
        2.3.6 組織化學(xué)染色
        2.3.7 POD、SOD、MDA測(cè)定
        2.3.8 lmd、G21、WT株系抗病性分析
    2.4 本章小結(jié)
3 白樺早衰形成相關(guān)基因表達(dá)的分析
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄
        3.2.2 RNA文庫(kù)的構(gòu)建及測(cè)序
        3.2.3 轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)質(zhì)量評(píng)估
        3.2.4 基因表達(dá)量及差異基因分析
        3.2.5 qRT-PCT方法驗(yàn)證表達(dá)譜測(cè)序結(jié)果
        3.2.6 內(nèi)源激素含量的測(cè)定
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 RNA的獲得
        3.3.2 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與評(píng)估
        3.3.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)質(zhì)量評(píng)估
        3.3.4 差異表達(dá)基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)
        3.3.5 lmd、G21和WT 3個(gè)株系功能葉片差異基因分析
        3.3.6 基因共表達(dá)分析
        3.3.7 qRT-PCR驗(yàn)證
        3.3.8 lmd突變株早衰分子機(jī)制分析
    3.4 本章小結(jié)
4 T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列分析
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 白樺總DNA的提取
        4.2.2 Southern雜交
        4.2.3 早衰突變體lmd基因組重測(cè)序
        4.2.4 TAIL-PCR
        4.2.5 插入位點(diǎn)的驗(yàn)證
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 白樺總DNA的獲得
        4.3.2 T-DNA插入位點(diǎn)數(shù)的確定
        4.3.3 lmd突變株基因組重測(cè)序分析
        4.3.4 T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列的獲得
        4.3.5 插入位點(diǎn)的驗(yàn)證
    4.4 本章小結(jié)
5 白樺BpEIN3基因功能初步研究
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 植物材料
        5.1.2 載體與菌株
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 BpEIN3啟動(dòng)子的生物信息學(xué)分析
        5.2.2 BpEIN3啟動(dòng)子的克隆及表達(dá)載體構(gòu)建
        5.2.3 BpEIN3基因克隆及過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建
        5.2.4 BpEIN3基因抑制表達(dá)載體構(gòu)建
        5.2.5 工程菌的制備及遺傳轉(zhuǎn)化
        5.2.6 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)及基因定量分析
        5.2.7 BpEIN3啟動(dòng)子的活性分析
        5.2.8 轉(zhuǎn)基因植株的表型觀察
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 BpEIN3啟動(dòng)子序列順式作用元件分析
        5.3.2 BpEIN3啟動(dòng)子的克隆及表達(dá)載體構(gòu)建
        5.3.3 BpEIN3基因的克隆及表達(dá)載體構(gòu)建
        5.3.4 BpEIN3基因抑制表達(dá)載體構(gòu)建
        5.3.5 轉(zhuǎn)基因植株的PCR及qRT-PCR檢測(cè)
        5.3.6 BpEIN3啟動(dòng)子的活性分析
        5.3.7 轉(zhuǎn)基因植株的表型觀察
    5.4 本章小結(jié)
6 討論與結(jié)論
    6.1 討論
        6.1.1 植物葉片衰老與細(xì)胞程序性死亡
        6.1.2 植物葉片早衰與抗病性的關(guān)系
        6.1.3 植物葉片衰老與基因表達(dá)
        6.1.4 植物EIN3基因在衰老和類(lèi)病斑形成中的調(diào)控機(jī)制
    6.2 結(jié)論
    6.3 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝
附件


【參考文獻(xiàn)】：
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