發(fā)布時(shí)間：2020-11-01 09:44

　　 水稻是全世界最重要的糧食作物之一,同時(shí)也是冷敏感作物。孕穗期冷害是影響水稻穗部形態(tài)建成和制約水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要因素之一。在我國(guó),孕穗期冷害主要發(fā)生在高緯度和高海拔地區(qū),尤其是位于粳稻主產(chǎn)區(qū)的東三省更是孕穗期冷害的頻發(fā)區(qū)。但由于孕穗期耐冷性具有復(fù)雜的遺傳機(jī)制,受微效多基因控制,且對(duì)環(huán)境較敏感,能夠穩(wěn)定遺傳的耐冷QTL為數(shù)較少,從而導(dǎo)致耐冷遺傳研究較為緩慢。因此,發(fā)掘孕穗期耐冷主效QTL是挖掘耐冷基因的基礎(chǔ),同時(shí),對(duì)分子標(biāo)記輔助選擇在耐冷品種的選育上具有重要指導(dǎo)作用。因此,本研究利用東農(nóng)422和空育131建立的高世代重組自交系群體在連續(xù)三年的大田環(huán)境下進(jìn)行了孕穗期耐冷鑒定,考察了包括穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、穗重、穗數(shù)、結(jié)實(shí)率和抽穗期在內(nèi)的8個(gè)性狀在自然灌溉和冷水灌溉下的表型值,且結(jié)合對(duì)應(yīng)的冷水反應(yīng)指數(shù)進(jìn)行了QTL分析和環(huán)境與基因間的互作分析。同時(shí),我們將QTL結(jié)果和meta分析相結(jié)合,對(duì)QTL定位結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,以期找出控制水稻耐冷性的重要染色體區(qū)間,挖掘區(qū)間耐冷候選基因。并通過多年表型鑒定,以孕穗期冷敏感最強(qiáng)的結(jié)實(shí)率為指標(biāo)構(gòu)建了抗感池,結(jié)合二代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行了耐冷QTL區(qū)間的關(guān)聯(lián),對(duì)比QTL分析和BSA分析的結(jié)果,將兩種方法下共同檢測(cè)到的QTL區(qū)間作為孕穗期耐冷性區(qū)間,并在該區(qū)間中進(jìn)行耐冷候選基因的挖掘。主要研究結(jié)果如下:1.通過對(duì)190個(gè)RIL家系和雙親的8個(gè)性狀進(jìn)行鑒定后發(fā)現(xiàn),結(jié)實(shí)率,一次枝梗數(shù),二次枝梗數(shù),穗重,穗數(shù)和抽穗期對(duì)冷水脅迫較敏感,可以作為孕穗期耐冷鑒定的指標(biāo)來對(duì)耐冷性做出綜合評(píng)價(jià)。相關(guān)性分析表明,除了結(jié)實(shí)率,其它性狀的相關(guān)性達(dá)到顯著。穗長(zhǎng),穗粒數(shù),穗重和抽穗期的表型主要受基因型決定,一次枝梗數(shù),二次枝梗數(shù),穗數(shù)和結(jié)實(shí)率的表型受環(huán)境影響較大。QTL分析結(jié)果表明,冷水脅迫下結(jié)實(shí)率和其余幾個(gè)耐冷性狀的遺傳模式存在差異,性狀間相關(guān)分析和超幾何概率函數(shù)對(duì)QTL的相關(guān)分析驗(yàn)證了這一結(jié)論。2.研究構(gòu)建了包含158對(duì)SSR標(biāo)記的遺傳圖譜,兩親本的基因型在后代中均呈現(xiàn)正態(tài)分布,表明該群體適合遺傳作圖的研究,是遺傳研究的理想群體。3.利用ICIMapping軟件定位QTL,結(jié)果表明,對(duì)照和冷水脅迫下分別檢測(cè)到32和29個(gè)QTL,同時(shí)在對(duì)照和冷水脅迫下檢測(cè)到的有8個(gè)。其中,對(duì)照條件下,貢獻(xiàn)率大于10%的QTL有20個(gè),增效等位基因來源于東農(nóng)422的占了18個(gè);冷水脅迫下,貢獻(xiàn)率大于10%的QTL有16個(gè),增效等位基因來源于東農(nóng)422的占了13個(gè);和冷水反應(yīng)指數(shù)相關(guān)的QTL有28個(gè),貢獻(xiàn)率大于10%的為15個(gè),增效等位基因來源于空育131的占了9個(gè)。確定了17個(gè)主效QTL和孕穗期耐冷性相關(guān),分別為qPL7-1、qGN7-3、qPBN7-1、qPBN7-2、qSBN7-1、qGY11-1、qGY2-2、qGY3-1、qGY5-1、qGY7-2、qPN7-1、qPN7-2、qPSS6-2、qPSS7-1、qHD6-1、qHD7-1、qHD7-3。其中qGY2-2、qPSS6-2、qHD7-3、q GY11-1是新發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)。并利用一對(duì)極端株系對(duì)穩(wěn)定遺傳的主效QTL qPSS6-2進(jìn)行了驗(yàn)證,發(fā)掘了9個(gè)攜帶耐冷位點(diǎn)可用于遺傳改良的株系。4.單環(huán)境分析,單處理聯(lián)合分析和全部環(huán)境聯(lián)合分析共同檢測(cè)到18個(gè)QTL,分別為qPL7-1、qGN1-2、qGN1-3、qGN6-2、qGN7-2、qGN7-1、qGN11-1、qPBN7-1、qGY1-1、qGY1-2、qGY6-3、qGY7-2、qGY7-1、qPN7-1、qPN11-1、qPSS6-2、qHD7-1和qHD11-1,且均為顯著QTL。其中qGN7-2、qGN11-1、qGN6-2、qPBN7-1、qGY7-2、qGY6-3、qPN7-1、qPSS6-2和qHD7-1屬于環(huán)境穩(wěn)定型QTL。且三種分析模式下分別檢測(cè)到17個(gè),16個(gè)和14個(gè)多效性QTL區(qū)間,分布在11條染色體上的33個(gè)遺傳區(qū)間中。5.QTL×環(huán)境互作分析表明,qPL7-1、qSBN7-1、qPN6-1、qPN6-2在對(duì)照環(huán)境下檢測(cè)到顯著的互作效應(yīng),qGY1-1、qGY7-2、qPN7-1、qHD1-2、qHD6-2和qHD7-1在冷水處理下檢測(cè)到顯著環(huán)境互作效應(yīng)。同時(shí),19個(gè)QTL在全部環(huán)境聯(lián)合分析下檢測(cè)到顯著的環(huán)境互作效應(yīng)�？梢奞TL×環(huán)境方差在群體總方差中的作用因環(huán)境的不同而不同,環(huán)境因素對(duì)性狀遺傳具有重要作用。6.QTL相關(guān)性分析表明,相比對(duì)照環(huán)境,冷水脅迫能顯著提高QTL的相關(guān)性,且環(huán)境越多,這種相關(guān)度越緊密。這間接反映了冷水脅迫下性狀的遺傳關(guān)聯(lián)性,這可能是特定環(huán)境下的遺傳關(guān)聯(lián),也可能是冷水脅迫改變了性狀遺傳因子的表達(dá),使其具有了遺傳相似性。且QTL的這種相關(guān)性和表型相關(guān)達(dá)到高度一致,揭示了耐冷遺傳因子引起性狀變異的原因。7.Meta分析表明,共有189個(gè)水稻耐冷性QTL被整合到了物理圖譜上,圖譜覆蓋了水稻基因組370.26Mb的長(zhǎng)度,共發(fā)現(xiàn)了47個(gè)和水稻耐冷相關(guān)的一致性耐冷QTL位于12條染色體上。通過比較,發(fā)現(xiàn)其中7個(gè)一致性耐冷QTL的物理區(qū)間內(nèi)存在8個(gè)已報(bào)道的冷響應(yīng)基因,且本研究檢測(cè)到的20個(gè)與孕穗期耐冷相關(guān)的QTL落在了其中11個(gè)一致性耐冷QTL區(qū)間內(nèi)。通過生物信息學(xué)分析,確定了7個(gè)和耐冷相關(guān)的候選基因,分別為L(zhǎng)OC_Os08g38560、LOC_Os09g30190、LOC_Os01g07560、LOC_Os06g36920、LOC_Os02g10150、LOC_Os03g17220和LOC_Os02g09740。8.基于耐冷鑒定和QTL定位結(jié)果,確定了qPSS6-2為耐冷主效QTL。通過構(gòu)建結(jié)實(shí)率抗感池,重測(cè)序共獲得70.55Gbp的數(shù)據(jù)量,過濾后得到的clean reads為69.61Gbp,Q30達(dá)到85%,平均每個(gè)樣品測(cè)序深度為41.44X。樣品與參考基因組平均比對(duì)效率為99.18%,平均覆蓋深度為39X,基因組覆蓋度為98.29%�；�于ED和SNP-index的關(guān)聯(lián)算法,共注釋到12個(gè)和冷響應(yīng)有關(guān)的候選基因,經(jīng)擬合算法之后,關(guān)聯(lián)區(qū)間縮小為3.68Mb,注釋到4個(gè)冷響應(yīng)基因。將BSA-Seq和QTL定位結(jié)果進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)有9個(gè)QTL區(qū)間和BSA-Seq結(jié)果重疊,共同定位到6號(hào)染色體上一段1.81Mb的區(qū)段,包含了212個(gè)成功注釋的基因,其中僅有兩個(gè)基因(LOC_Os06g39740和LOC_Os06g39750)和冷脅迫響應(yīng)有關(guān)。且該區(qū)間僅有的13個(gè)非同義突變包含了LOC_Os06g39750。該基因在雙親和抗感池間存在氨基酸變異,被認(rèn)為是qPSS6-2的候選基因。qRT-PCR結(jié)果表明,LOC_Os06g39750在耐冷親本空育131中受冷脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo)。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S511
【部分圖文】：

12圖 1-1 水稻孕穗期耐冷性 QTL 在染色體上的分布Figure 1-1 Distribution of cold tolerant QTLs on chromosomes at booting stages in rice而對(duì)于水稻耐冷性基因的研究，前人也做了大量探索，如圖 2 所示，經(jīng)不完全統(tǒng)計(jì)，

14圖 1-2 與水稻耐冷性調(diào)控相關(guān)的克隆基因在基因組上的分布Figure 1-2 The distribution of clonal genes related to cold tolerance in rice genome1.4.3 水稻耐冷性的主要調(diào)控機(jī)制研究表明，水稻耐冷主要有 CBF (Calmodulin-binding transcription activator)、MYB(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)、ICE(Inducer of CBF expression)等轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控[76]，包括冷刺激信號(hào)的傳導(dǎo)，轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控以及基因響應(yīng)。CBF/DREBs 是冷刺激下主要的調(diào)節(jié)因子，主要通過激活一系列靶基因來起到耐冷的作用[77-79]。CBF 參與的耐冷調(diào)控主要分為 CBF1、CBF2、CBF3 三種類型[80-81]，且處于相同的調(diào)控水平[79]。這一調(diào)控方式首先在擬南芥中被發(fā)現(xiàn)，后有研究表明，該調(diào)控模式在植物中是普遍存在的[82]，而在水稻中，參與調(diào)控耐冷性的 CBF 因子有 12 個(gè)[83]。鈣離子作為低溫傳遞的信使，結(jié)合鈣調(diào)蛋白和膜系統(tǒng)，成為信號(hào)結(jié)合物，鈣離子和鈣調(diào)蛋白參與冷刺激信號(hào)的感受，傳遞及響應(yīng)。同時(shí)將信號(hào)傳遞到激酶和磷酸酶活性的調(diào)控中，從而激發(fā)蛋白功能，致使下游 CBF 基因的表達(dá)，產(chǎn)物同上游啟動(dòng)子調(diào)控原件（CRT/DRE）結(jié)合，以此來控制基因表達(dá)。

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【參考文獻(xiàn)】

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