發(fā)布時間：2020-11-19 22:55

　　 銅(Cu)是生物體生長和發(fā)育所必需的微量元素,但過量的Cu也會對生物體造成毒害�？刂谱魑镏蠧u離子的平衡,對提高作物產(chǎn)量和營養(yǎng)品質(zhì),以及人體健康都是十分重要的。銅伴侶蛋白ATX1(Antioxidant Protein1)是維持細胞內(nèi)Cu離子平衡的一類重要蛋白。在本研究中,我們鑒定了一個水稻銅伴侶蛋白OsATX1,功能研究表明OsATX1影響了水稻中Cu離子的轉(zhuǎn)運和分配。RT-qPCR結果表明,OsATX1受高濃度Cu和鎘(Cd)的誘導表達,但不受高濃度鐵(Fe)、錳(Mn)或鋅(Zn)的影響。通過對攜帶OsATX1_(Pro):GUS/GFP(OsATX1啟動子融合GUS(β-葡萄糖苷酸酶)和GFP(綠色熒光蛋白))的轉(zhuǎn)基因水稻的分析,我們發(fā)現(xiàn)OsATX1主要在根部的外皮層和木質(zhì)部細胞以及葉片維管組織中表達。水稻原生質(zhì)體和煙草葉片表皮細胞的瞬時表達實驗結果表明,OsATX1-GFP定位于細胞質(zhì),細胞核和細胞質(zhì)膜,也可能依附于細胞內(nèi)膜系統(tǒng)。OsATX1功能缺失會導致水稻根中Cu濃度增加,并降低了Cu由根向地上部的轉(zhuǎn)移;超量表達OsATX1降低了根中的Cu濃度,但增加了植株地上部和木質(zhì)部傷流液中Cu的積累,并促進了Cu由根向地上部的轉(zhuǎn)移。在缺Cu條件下,OsATX1超量表達植株與野生型相比沒有表現(xiàn)出明顯的表型差異;但是超量表達OsATX1顯著降低了水稻對高濃度Cu的耐受性。在生殖生長階段,與野生型相比,OsATX1超量表達植株在新發(fā)育組織中的Cu濃度顯著增加,包括穗,上部節(jié)點和節(jié)間,幼葉和葉鞘;而osatx1突變體植株在這些組織中的Cu濃度顯著降低。另外,osatx1突變體植株在老葉中積累了較高的Cu濃度。OsATX1包含一個保守的MXCXXC銅離子結合結構域,能夠與Cu~+離子結合,形成同源二聚體。酵母雙雜交和雙分子熒光互補(BiFC)實驗結果表明,OsATX1能夠與水稻重金屬P_(1B)型ATP酶OsHMA4,OsHMA5,OsHMA6和OsHMA9互作。這些結果表明,OsATX1可能負責將Cu離子傳遞給水稻重金屬P_(1B)型ATP酶進行Cu離子的轉(zhuǎn)運和分配,從而維持水稻不同組織間的Cu離子平衡。超量表達OsATX1增加了地上部和木質(zhì)部傷流液中的Cd積累,而osatx1突變體植株增加了根中的Cd濃度。在生殖生長階段,超量表達OsATX1增加了地上部各個組織器官的Cd積累,表明OsATX1也可能參與水稻中Cd離子的轉(zhuǎn)運。另外,在酵母(釀酒酵母)鎘敏感突變體Δycf1中,異源表達OsATX1能夠降低酵母細胞中Cu和Cd的濃度,從而提高了酵母對Cu和Cd的耐受性。綜上所述,我們的研究結果表明,OsATX1促進了Cu由根向地上部的轉(zhuǎn)運以及從老葉到新發(fā)育組織的再分配。
【學位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S511
【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
1 前言
    1.1 研究問題的由來
    1.2 銅元素的概述
    1.3 銅的生物學功能
    1.4 銅高積累植物的研究
    1.5 銅在植物體內(nèi)的吸收和轉(zhuǎn)運
        1.5.1 CTR/COPT轉(zhuǎn)運蛋白
        1.5.2 P1B型 ATP酶/重金屬ATP酶
        1.5.3 鋅鐵轉(zhuǎn)運蛋白（Zinc/iron-regulated transporter protein,ZIP）
        1.5.4 類黃色條紋轉(zhuǎn)運蛋白YSL（Yellow stripe-like protein）
        1.5.5 銅伴侶蛋白
        1.5.6 銅響應的microRNAs（Cu-microRNAs）
    1.6 植物對銅毒害的防御
        1.6.1 銅離子的螯合作用
        1.6.2 植物抗氧化系統(tǒng)
    1.7 鎘元素概述
    1.8 鎘在植物體內(nèi)的吸收和轉(zhuǎn)運
    1.9 本研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 基因編號和名稱
    2.2 水稻材料
    2.3 菌株和載體
    2.4 遺傳轉(zhuǎn)化載體的構建與轉(zhuǎn)化方法
        2.4.1 啟動子融合載體的構建
        2.4.2 超量表達體的構建
        2.4.3 CRISPR載體的構建
        2.4.4 農(nóng)桿菌介導的水稻遺傳轉(zhuǎn)化
    2.5 RNA表達分析和突變體基因型鑒定
    2.6 營養(yǎng)液培養(yǎng)
    2.7 金屬元素含量分析
    2.8 木質(zhì)部傷流液的提取
    2.9 GUS組織化學染色及瓊脂切片
    2.10 水稻原生質(zhì)體的瞬時表達
    2.11 煙草葉片的瞬時表達
    2.12 酵母雙雜交實驗
    2.13 酵母互補實驗
        2.13.1 酵母互補測驗
        2.13.2 酵母生長速率實驗
        2.13.3 酵母細胞的元素含量分析
    2.14 蛋白質(zhì)的原核表達及純化
    2.15 銅離子結合實驗
3 結果與分析
    3.1 OsATX1 基因的序列分析
        3.1.1 ATX蛋白的進化樹分析
        3.1.2 ATX蛋白質(zhì)結構域的分析
    3.2 OsATX1 組織表達模式分析
        3.2.1 OsATX1 的表達譜分析
        3.2.2 OsATX1 細胞水平的表達特點
    3.3 金屬脅迫下OsATX1 基因的表達分析
    3.4 OsATX1 基因超量表達及突變體材料的獲得與鑒定
    3.5 OsATX1 轉(zhuǎn)基因植株的表型鑒定
    3.6 Fe,Mn,Zn和 Cu脅迫處理下OsATX1 轉(zhuǎn)基因植株的表型分析
    3.7 OsATX1 亞細胞定位分析
    3.8 營養(yǎng)生長期OsATX1 轉(zhuǎn)基因植株的Cu和 Cd梯度處理實驗及元素含量分析
        3.8.1 OsATX1 影響了水稻中Cu由根向地上部的轉(zhuǎn)運
        3.8.2 OsATX1 影響了水稻中Cd由根向地上部的轉(zhuǎn)運
        3.8.3 超量表達OsATX1 增加了木質(zhì)部傷流液中Cu和 Cd的積累
    3.9 抽穗期OsATX1 轉(zhuǎn)基因植株不同器官組織中Cu和 Cd元素含量分析
        3.9.1 OsATX1 影響了水稻中Cu由老葉向新發(fā)育組織和穗中的轉(zhuǎn)運
        3.9.2 超量表達OsATX1 增加了地上部不同組織中的Cd積累
    3.10 成熟期OsATX1 轉(zhuǎn)基因植株糙米中元素含量分析
    3.11 OsATX1 能夠結合Cu+離子
    3.12 OsATX1 與水稻P1B型重金屬ATP酶 OsHMA4/5/6/9 的互作分析
        3.12.1 酵母中驗證OsATX1與OsHMA4/5/6/9 互作
        3.12.2 BiFC驗證OsATX1與OsHMA4/5/6/9 互作
    3.13 酵母中異源表達OsATX1 對酵母Cu和 Cd耐性的影響
        3.13.1 酵母中異源表達OsATX1 增加了酵母對Cu的耐性
        3.13.2 酵母中異源表達OsATX1 增加了酵母對Cd的耐性
4 討論
    4.1 OsATX1 在水稻Cu轉(zhuǎn)運和分配過程中的功能
        4.1.1 OsATX1 參與水稻中Cu從根向地上部的轉(zhuǎn)運
        4.1.2 OsATX1 參與水稻地上部不同組織器官間的Cu分配過程
        4.1.3 超量表達OsATX1 降低了水稻對高銅脅迫的耐受性
    4.2 OsATX1 可能通過與OsHMA4/5/6/9 互作影響水稻Cu離子的轉(zhuǎn)運和分配
    4.3 OsATX1 在水稻Cd轉(zhuǎn)運和分配過程中的作用
    4.4 展望
參考文獻
附錄
    附錄 Ⅰ 引物列表
    附錄 Ⅱ 部分實驗的詳細操作步驟
    附錄 Ⅲ 作者簡介
致謝

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 李芳林;張凝宇;李輝;李倩蘭;王金林;;氯化鎘對人腎小管上皮細胞形態(tài)及生存率的影響[J];廣西醫(yī)學;2015年03期

2 吳茂江,涂長信;銅與人體健康[J];微量元素與健康研究;2005年05期

本文編號：2890554