發(fā)布時間：2020-11-08 15:51

　　 干巴菌(Thelephora ganbajun Zang),屬擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、革菌科(Thelephoraceae)、革菌屬(Thelephora),是云南省珍稀的野生食用菌,具有較高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值。目前對于干巴菌的報道大多集中在形態(tài)結(jié)構(gòu)、干巴菌成分的分析、遺傳差異以及生態(tài)效應(yīng)方面,對于干巴菌基因和生長機理方面的研究甚少。本研究主要運用實時定量PCR技術(shù)來測定干巴菌生長的不同土壤深度和范圍的菌絲體含量,從而探究干巴菌的生長和子實體形成機理。通過對干巴菌單拷貝基因和多拷貝基因測定土壤菌絲體含量的比較,探討單拷貝基因和多拷貝基因測定土壤菌絲體的優(yōu)缺點和可行性。本研究應(yīng)用多拷貝基因?qū)崟r定量PCR方法對云南常見的外生菌根真菌銅綠菌(Lactarius hatsudake)進行了土壤菌絲體含量的測定,發(fā)現(xiàn)干巴菌與銅綠菌在子實體形成過程中土壤的菌絲體含量及分布存在一定的差異性。本研究得出的主要結(jié)果如下:1、目前現(xiàn)有的單拷貝基因引物主要針對口蘑屬,本研究摸索了其引物對干巴菌DNA的擴增,結(jié)果沒有獲得單一條帶和有效序列,因此現(xiàn)有單拷貝基因引物不適用于干巴菌單拷貝基因的擴增。本研究通過基因組比較,找到了干巴菌的單拷貝基因,在此基礎(chǔ)上設(shè)計并驗證了特異性引物;通過比對銅綠菌與相近物種的ITS序列設(shè)計并驗證了特異性引物。上述兩對特異性引物的成功合成,為土壤中菌絲體含量的實時定量測定提供可實施的必要條件。2、多拷貝基因與單拷貝基因?qū)崟r定量PCR測定方法的結(jié)果有成倍增加和減少的趨勢大體一致,但也存在一定的差異。兩種基因測得的干巴菌菌絲體含量,比值在1-29之間。少量樣品比值差異性較大,倍數(shù)在1-3左右,而比值在5-16之間的占總數(shù)的57.14%。如果測定干巴菌菌絲體含量用來研究干巴菌菌絲體的分布狀況,也可以考慮使用多拷貝基因來測定作為參考。3、根據(jù)實時定量PCR測定土壤菌絲體含量分析比較發(fā)現(xiàn)銅綠菌與干巴菌子實體形成的過程存在較大差異,土壤中干巴菌菌絲體分布不具菌塘規(guī)律性,銅綠菌菌絲體在土壤中分布具有一定的規(guī)律性。推斷銅綠菌在子實體形成過程中,可能其菌絲侵入植物體根部,吸收根部的營養(yǎng)物質(zhì),菌絲體含量逐漸增多并在土壤中逐漸向外延伸,當(dāng)土壤環(huán)境較為適合時,銅綠菌菌絲體逐漸聚集增多形成菌塘,從而形成子實體。4、通過觀察發(fā)現(xiàn)干巴菌在子實體的形成過程中,其菌絲侵入松樹等的根部,進入根部細(xì)胞間隙,然后向根外延伸形成二叉分支結(jié)構(gòu)的菌根,而后菌根逐漸增多聚集,聚集到一定程度時形成子實體。在此過程中有少量菌絲體分散在土壤中,但不形成菌塘。根據(jù)這一特征,在干巴菌的人工栽培過程中,可以通過提高干巴菌侵染以及控制寄主松樹的生長狀況來實現(xiàn),但還需進一步探索。
【學(xué)位單位】：云南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S646
【部分圖文】：

２．１．３瓊脂糖凝膠電泳及測序??�。玻蓿蹋校茫耶a(chǎn)物在２％瓊脂糖凝膠上電泳，ＧｅｎｅＦｉｎｄｅｒＴＭ染色，紫外透??射儀檢測見圖２。將有單一條帶的ＰＣＲ產(chǎn)物送到昆明碩擎生物科技有限公司測??序，測序均未獲得有效序列，見圖２。??應(yīng)用上述物種的單拷貝基因引物，均未成功擴增出干巴菌的相應(yīng)基因片段。??１５??

Ｆｉｇｕｒｅ?４?Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?ｍａｐ?ｏｆ?ｐａｒｔｉａｌ?ｐｒｉｍｅｒ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ｓｉｎｇｌｅ?ｃｏｐｙ?ｇｅｎｅ?ｏｆ??Ｔｈｅｌｅｐｈｏｒａ?ｇａｎｂａｊｕｎ?Ｚａｎｇ??２．２．３干巴菌單拷貝基因的驗證??割膠回收：準(zhǔn)備Ａ６、Ａ１４、Ａ２８、Ａ４５、Ａ５０和Ａ５１這６對引物擴增的ＰＣＲ產(chǎn)??物，�。玻颠玻校茫覕U增產(chǎn)物和５卟Ｕｎｌｏａｄｉｎｇ?ｂｕｆｆｅｒ混勻，２％的瓊脂糖凝膠電??泳，ＰＣＲ產(chǎn)物回收時做割膠回收。具體回收具體步驟按照從云南晨綠生物科技??有限公司購買的天根ＤＮＡ純化回收試劑盒（貨號為：ＤＰ２１４）操作，把回收的??ＤＮＡ放到－２０°Ｃ保存?zhèn)溆谩??ＤＮＡ片段兩端連接腺嘌呤：由于ＰＣＲ試劑金牌ＭＩＸ擴增的基因片段兩端沒有??連接腺嘌呤，回收的ＤＮＡ片段兩端需要加入腺嘌呤。反應(yīng)體系為：回收產(chǎn)物??２２??

?云南大學(xué)碩士畢業(yè)論文???的甘油溶液（按照１：?５的比例加入），固定在搖床上１８０轉(zhuǎn)３７°Ｃ培養(yǎng)１?ｈ，然??后放置于－２０＂Ｃ的冰箱中保存。??測序結(jié)果用ｓｅｑＭａｎ和ＢｉｏＥｄｉｔ軟件進行比對，３０個插入載體中單克隆的序??列進行比對并與之前ＰＣＲ擴增序列及從基因組中挑選出來的原單拷貝基因序??列比對，序列完全相同的有：引物Ａ６、Ａ２８、Ａ５０和引物Ａ５１擴增的基因片段，??分別見圖５、圖６、圖７和圖８。因此引物Ａ６、Ａ２８、Ａ５０和引物Ａ５１均為干??巴菌單拷貝基因特異性引物。??＊ｅ－１?Ｇ：：：．?：?：?：?ｒａｒＣ／＾．－－ＧｒＡ?■?：ＧＧ＾ｒ３＊ＣＧＡ：?；?．?：?ｒＴＣＣ：Ｃ．?；?．?Ｔ?：?Ａ?久；《〇〇：．二〇；：－．｜１＊�。簭V－－－－：ｓ：?／ＧＧ：１：??Ａ４－２?ａ．－．?Ｃ?．３．?；；Ｇ５－．．－３；．ｔ５Ｃ；．?？－?．：?Ｇ?：．?：?．?：：■：．?．?．－３；．?．?．?Ｓ３３；．?ＡＣＣ?．?Ｊ－－?ＣＡ?；?：ｒ〇．?．?Ｃ?．?３?．?．Ｃｉ．：??－－＊＊＊－＇?■￣－＇
【參考文獻】

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本文編號：2874996