發(fā)布時間：2020-11-09 12:24

　　 龍眼(Dimocarpus longan Lour.)屬無患子科(Sapindaceae)龍眼屬,是著名的熱帶亞熱帶特色果樹。龍眼體細胞胚胎發(fā)生(somatic embryogenesis,SE)系統是研究龍眼胚胎發(fā)育的良好系統。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)參與可變切割、轉錄干擾、DNA甲基化調節(jié)和蛋白質修飾,但對于lncRNAs在植物體胚發(fā)生過程中的研究還未見報道。在本研究中,以胚性愈傷組織(embryonic callus,EC)、不完全胚性緊實結構(Incomplete embryonic compact structure,ICpEC)、球形胚(globular embryo,GE)為試驗材料,采用Ⅲumina HiSeq測序技術系統地鑒定了龍眼體胚發(fā)生早期3個階段的lncRNAs;對lncRNAs的差異顯著性分析結果,進行篩選及表達分析;通過KEGG富集分析,構建生長素、脫落酸與乙烯響應因子相關的lncRNAs調控網絡,進行龍眼SE早期以及在相應激素處理下的表達分析,并對lncRNAs靶基因ERF相關的家族成員進行鑒定;預測lncRNAs與miRNA的作用關系網絡,通過miRNA的過表達與抑制表達處理,使用實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)技術對其相關的lncRNAs與mRNAs進行表達量驗證;構建lncRNAs的過表達載體,通過PEG轉化與農桿菌介導法轉入龍眼原生質體與胚性愈傷組織。研究內容主要如下:1龍眼體胚發(fā)生早期相關的lncRNAs的鑒定與靶基因預測采用Ⅲumina HiSeq測序技術對龍眼的3個樣本(EC、ICpEC與GE)進行高通量測序,鑒定新型lncRNAs為7643個,其中6005個檢測到表達。通過樣本間兩兩對比的差異表達lncRNAs發(fā)現,在龍眼早期SE過程中,GE階段存在更多特異的lncRNAs,作用主要在ICpEC到GE階段。lncRNAs的功能主要通過cis或trans方式作用于靶基因來實現,對lncRNAs差異顯著的靶基因進行KEGG富集分析發(fā)現,在EC vs.GE與ICpEC vs.GE中“植物-病原菌互作”與“植物激素信號轉導”途徑最富集。2龍眼體胚發(fā)生早期lncRNAs及其靶基因的篩選與表達分析為了確定龍眼早期SE顯著差異lncRNAs的表達,挑選了20個在RNA-Seq中表達量差異顯著lncRNAs以及5個與植物激素信號轉導相關的lncRNAs進行qRT-PCR驗證。除了LTCONS-00027337之外,其余24個lncRNAs均可以在EC、ICpEC與GE中檢測到表達。結果顯示,24個lncRNAs中有16個lncRNAs的RNA-Seq與qRT-PCR的表達趨勢一致。為進一步了解“植物激素信號轉導”途徑在龍眼體胚發(fā)生早期的作用,鑒定了其中6個關鍵的lncRNAs。在qRT-PCR中,6個lncRNA對其靶基因均為正調控關系,并且為順式調節(jié)的。推測與植物激素信號轉導相關的lncRNA主要在早期龍眼SE中起順式調控的作用。對lncRNAs靶基因ERF家族進行系統地鑒定,并對5個在龍眼早期SE過程中富集的ERF基因進一步分析發(fā)現。結果進一步表明,隨著龍眼早期SE進行內源激素等方面發(fā)生顯著變化,為了促進胚胎的正常發(fā)育,需要更多的DlERF基因參與。通過對5個在龍眼早期SE差異顯著表達的DlERF基因進行qRT-PCR與RNA-Seq表達結果對比發(fā)現,大部分在龍眼早期SE 3個階段的表達趨勢一致,且其中3個DlERF基因在龍眼GE階段表達量最高。由此可見,從EC到GE階段需要更多的ERF基因來參與GE階段的維持,也進一步說明在早期SE過程中,細胞分裂分化和抗性等方面也逐漸增強。使用不同濃度的外源激素處理龍眼胚性愈傷組織,從復雜的關系網絡中可以看出,作為植物激素相關的lncRNAs,在龍眼SE過程中發(fā)揮著至關重要的作用。3龍眼體胚發(fā)生早期lncRNAs與miRNAs調控關系除了與編碼蛋白相互作用外,lncRNAs也可能與miRNA相互作用。本試驗預測了龍眼lncRNAs作為miRNA的前體、靶基因以及內源誘捕靶標(endogenous target mimic,eTM)。為了進一步驗證在龍眼SE早期發(fā)育期間lncRNA、miRNA和mRNA之間的關系,對Dlo-miR172a、Dlo-miR159a.1和Dlo-miR398a的預測網絡進行qRT-PCR驗證。通過對Dlo-miR172a、Dlo-miR159a.1和Dlo-miR398a過表達和抑制表達的樣品中表達量分析,我們發(fā)現了龍眼中早期SE期間Dlo-miR172a與其相關的lncRNA和mRNA具有與預測相同的表達趨勢。然而,DlomiR398a、Dlo-miR159a.1與其相關的mRNA和lncRNA之間的調節(jié)關系復雜,需要進一步探索。4龍眼體胚發(fā)生早期lncRNAs的過表達載體構建及瞬時表達本試驗構建了LTCONS-00042843與LTCONS-00006334的過表達載體,利用農桿菌介導法與PEG轉化法,實現了LTCONS-00042843與LTCONS-00006334在龍眼原生質體與愈傷組織中過表達。從qRT-PCR結果中看出,在原生質體中,LTCONS-00042843與LTCONS-00006334及其靶基因均表現為顯著上升,也進一步驗證了LTCONS-00042843與LTCONS-00006334對其靶基因為正調控關系。LTCONS-00042843作為miR172a的eTM,對其存在負調控作用。但對于轉入龍眼愈傷時,LTCONS-00042843與LTCONS-00006334的靶基因均表現出相反的趨勢,與在體胚中的調控以及轉入龍眼原生質體中的趨勢存在差異,推測是由于試驗的材料不同導致其調控網絡或調控偏好性存在差異。
【學位單位】：福建農林大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S667.2
【部分圖文】：

圖 2-1 龍眼體胚發(fā)生早期 lncRNAs 的長度分布Fig.2-1 Length distribution of lncRNAs during early longan SE圖 2-2 龍眼體胚發(fā)生早期 lncRNAs 的外顯子數目分布Fig.2-2 Exon number distribution of lncRNAs during early longan SE

22圖 2-2 龍眼體胚發(fā)生早期 lncRNAs 的外顯子數目分布Fig.2-2 Exon number distribution of lncRNAs during early longan SE對 7643 個 lncRNAs 以及 47169 個 mRNAs 進行表達量分析表達的新型 lncRNAs 為 6005 個，新型 mRNAs 為 15233 個 23886 個。在 6005 個新型 lncRNAs 在 3 個樣本中的分布為ICpEC 階段 5320 個以及 GE 階段 5568 個。其中 3 個樣本共有的790 個；EC 與 ICpEC 共有的有 139 個；ICpEC 與 GE 共有的有 共有的有 165 個。對 687 個特異表達 lncRNAs 分析中發(fā)現 lncRNAs 為 159 個、ICpEC 中為 153 個、GE 中為 375 個。

圖 2-3 EC、ICpEC 和 GE 樣本間特異表達 lncRNAs 的 Venn 圖iagram showing the specifically expressed lncRNAs between ECsamples發(fā)生早期 lncRNAs 分類與家族注釋05 個 lncRNAs 相對于最接近編碼蛋白基因位置，將 34編碼蛋白沒有任何重疊的基因間 lncRNAs(intergenic基因座上的基因內 lncRNAs(intragenic lncRNAs)以及的反義 lncRNAs (antisense lncRNAs)[171; 172]。結果表93.37%的 lncRNAs 為基因間 lncRNAs，0.38% 的 lncR 6.25%的 lncRNAs 為反義 lncRNAs（圖 2-4）。As 家族注釋中，對比 RNA 的二級結構保守區(qū)域，m
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本文編號：2876427