發(fā)布時間：2020-11-10 03:44

　　 為了研究‘碭山酥梨’(Pyrus bretshneideri cv.Dangshansuli)果皮中精胺合成酶(Spermine synthase,SPMS)基因PbSPMS在梨果皮木栓質(zhì)形成過程中的作用,本文以野生型擬南芥為試材,將梨PbSPMS基因載體構(gòu)建成功后導(dǎo)入擬南芥,收獲T_0代種子,經(jīng)過抗性篩選及DNA檢測鑒定、純化獲得PbSPMS基因轉(zhuǎn)擬南芥的純合株系。本試驗通過對轉(zhuǎn)基因植株結(jié)構(gòu)觀察、各項生理指標(biāo)測定、差異性表達(dá)分析以及在非生物脅迫下PbSPMS轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長、多胺(腐胺、精胺和亞精胺)含量的變化、相關(guān)抗性生理指標(biāo)測定和差異性表達(dá)的影響,分析了PbSPMS基因的功能作用以及在逆境脅迫下的抗性,主要試驗結(jié)果如下:(1)PbSPMS轉(zhuǎn)擬南芥株系與野生型的莖段橫切面結(jié)構(gòu)及種子縱切面結(jié)構(gòu)有一定的差異:轉(zhuǎn)基因株系的相對維管束面積均較大于野生型,且木質(zhì)部中導(dǎo)管、管胞次生加厚的細(xì)胞壁較厚于野生型。同時,轉(zhuǎn)基因株系韌皮部左右均有3~4層排列較為緊密的束間纖維細(xì)胞與之連接,且較為明顯,而野生型則排列較為疏松,且不明顯;在種子縱切面中轉(zhuǎn)基因株系的胚根明顯壯于野生型。(2)PbSPMS轉(zhuǎn)擬南芥株系中多胺含量、H_2O_2含量、木栓質(zhì)總含量、酚類物質(zhì)含量,均高于野生型,結(jié)果表明,過表達(dá)PbSPMS基因可提高內(nèi)源多胺含量,從而會代謝出較多的H_2O_2與酚類物質(zhì)發(fā)生交連聚合栓質(zhì)化,從而形成較多的木栓質(zhì)。PbSPMS基因在擬南芥根、莖、葉、種中的表達(dá)有一定的組織差異性,PbSPMS基因在PbSPMS-1株系的根、莖、葉、種中均過表達(dá);PbSPMS-3株系除種組織以外,在根、莖、葉各組織中均是過表達(dá);而PbSPMS-2只在葉組織中過表達(dá)。(3)PbSPMS轉(zhuǎn)擬南芥株系在不同濃度非生物脅迫下的根長顯著高于野生型,且達(dá)到差異顯著性;同時與野生型的根系相比,PbSPMS轉(zhuǎn)擬南芥株系須根個數(shù)較多,根系較為發(fā)達(dá)。在鹽脅迫及干旱脅迫過程中,多胺含量變化趨勢總體上呈先升后降、再升,且其含量均高于野生型擬南芥。在低溫脅迫中除脅迫24 h時有所差異外,其轉(zhuǎn)基因株系多胺含量仍均高于野生型擬南芥。非生物脅迫下PbSPMS轉(zhuǎn)擬南芥株系內(nèi)的Pro、H_2O_2、POD及可溶性糖含量,在整體上,尤其是在脅迫48 h時仍高于野生型。PbSPMS基因在在鹽脅迫過程中PbSPMS轉(zhuǎn)基因株系的表達(dá)量在脅迫24 h時開始高于野生型,脅迫延長至48 h時,其表達(dá)量顯著高于野生型;干旱脅迫下,PbSPMS-1、PbSPMS-3的表達(dá)量一直顯著高于野生型,整體上呈先降后升的變化趨勢而PbSPMS-2的表達(dá)量則一直與野生型無差異;在低溫脅迫下,PbSPMS-1、PbSPMS-3的表達(dá)量一直顯著高于野生型,而PbSPMS-2的表達(dá)量則一直與野生型無差異,直到脅迫48 h時,顯著高于野生型。
【學(xué)位單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S661.2
【部分圖文】：

插圖和附表清單編號 插圖標(biāo)題 頁碼圖1-1 植物中多胺生物合成與降解途徑 1圖2-1 技術(shù)路線 7表3-1 多胺標(biāo)準(zhǔn)品在確定的分離條件下的回歸分析 12表3-2 酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品在確定的分離條件下的回歸分析 12表3-3 熒光定量 PCR 擴(kuò)增所需要的引物及其序列 13圖4-1 梨PbSPMS基因蛋白與其他物種蛋白的?

物種的相關(guān)基因蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。圖 4-1 顯示，梨中 SPMS 基因和蘋果MdSPMS 基因的親緣關(guān)系較近，同源性為 95%。圖4-1 梨PbSPMS基因蛋白與其他物種蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析注：0.01為步長值；分支節(jié)點數(shù)值為自舉支持率Fig. 4-1 Phylogenetic tree of PbSPMS in Pyrus and previously reported proteinNote: footstep is 0.01; Bootstrap values are shown on the left of each clade.4.2 梨 PbSPMS 轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得與鑒定采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染擬南芥花序，得到擬南芥 T0代種子，種子干燥消毒后撒播于 1/2 MS 培養(yǎng)基（培養(yǎng)基中加入 50 mg/mL 的卡那抗生素）平板上，得到了多株抗卡那植株。從中挑選出長勢良好的幼苗 13 株，轉(zhuǎn)至營養(yǎng)基質(zhì)正常栽培管理，待葉

提取基因組 DNA，利用 pBI121-SPMS 的特異引物 PCR 檢的鑒定（圖 4-2）。由圖 4-2 可知，13 株卡那抗性擬南芥均為轉(zhuǎn)基基因植株后，進(jìn)行正常栽培管理，待成熟時收集種子，隨后進(jìn)行種化。如圖 4-3 所示，將野生型擬南芥與轉(zhuǎn)基因植株的種子撒播于抗型擬南芥發(fā)芽后在生長發(fā)育過程中自然黃化死亡，轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)基抗性苗，否則仍會黃花死亡。由圖 4-3 可以看出，轉(zhuǎn)基因擬南芥株全板成活，說明 PbSPMS 轉(zhuǎn)基因擬南芥已純合。
【相似文獻(xiàn)】

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1 蔣向紅;梨PbSPMS基因轉(zhuǎn)擬南芥植株的功能與抗逆性分析[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

本文編號：2877428