發(fā)布時(shí)間：2020-11-15 16:11

　　 梅(Prunus mume Sieb.etZucc.)是薔薇目薔薇科李屬多年生核果類植物。梅果實(shí)營養(yǎng)豐富,含有多種利于人體代謝的氨基酸,被譽(yù)為保健食品。雌蕊是果實(shí)形成的基礎(chǔ),而在生產(chǎn)中,經(jīng)常出現(xiàn)雌蕊發(fā)育不良的現(xiàn)象。為揭示梅雌蕊發(fā)育的機(jī)理,本文在前人研究基礎(chǔ)上,克隆了 Pm-miR319a前體和其靶基因序列;明確了 Pm-miR319a對靶基因Pm-TCP4的切割作用;進(jìn)一步利用生物信息學(xué)方法對Pm-TCP4的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行了分析;同時(shí)對梅Pm-miRS 19a及其靶基因Pm-TCP4在雌蕊不同發(fā)育階段的表達(dá)進(jìn)行了分析,主要結(jié)果如下:1前人的研究表明miR319a可能與梅雌蕊發(fā)育相關(guān),我們克隆其前體序列,前體序列長229bp。對Pm-miR319a前體序列進(jìn)行了分析,預(yù)測了二級(jí)結(jié)構(gòu)。從數(shù)據(jù)庫中得到了 19個(gè)其他物種的miR319a前體序列和成熟體序列,經(jīng)過序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析,發(fā)現(xiàn)miR319a成熟體具有很高的保守性。這20個(gè)物種中,miR319a在進(jìn)化關(guān)系上具有種間差異性。此外,預(yù)測了 Pm-miR319a的靶基因。結(jié)果顯示,其靶基因包括Pm-TCP4,這與擬南芥相一致,表明miR319a靶基因具有保守性。2為了探究Pm-miR319a與梅雌蕊發(fā)育的關(guān)系,利用RT-PCR技術(shù)在梅栽培種'大嵌蒂'的花芽中克隆了這個(gè)基因的ORF。分析序列顯示Pm-TCP4編碼439個(gè)氨基酸,同NCBI上預(yù)測序列比對,比對結(jié)果吻合。經(jīng)5'RACE驗(yàn)證,Pm-miRS 19a切割Pm-TCP4。對Pm-TCP4進(jìn)行生物信息分析,結(jié)果顯示Pm-TCP4編碼的蛋白為親水性蛋白,無信號(hào)肽且定位在細(xì)胞核,并具有跨膜結(jié)構(gòu),可以推測出它可能在細(xì)胞核的核膜上發(fā)揮作用。為探究Pm-miRS 19a與Pm-TCP4在雌蕊發(fā)育中的作用奠定基礎(chǔ)。3為了探究Pm-miR319a及其靶基因Pm-TCP4在梅雌蕊發(fā)育中的作用,利用qRT-PCR技術(shù),檢測Pm-miR319a與Pm-TCP4在‘大嵌蒂’和‘龍眼’兩個(gè)品種及‘大嵌蒂’不同雌蕊間(正常雌蕊與褐化雌蕊)的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示,Pm-miR319a在梅品種‘大嵌蒂’和‘龍眼’中表達(dá)趨勢相近,且在‘大嵌蒂’中的表達(dá)量高于‘龍眼’中的表達(dá)量。觀察Pm-TCP4在兩個(gè)品種間的表達(dá)量,顯示Pm-TCP4在‘大嵌蒂’中的表達(dá)量明顯高于'龍眼'。而在'大嵌蒂'不同雌蕊表達(dá)分析顯示,Pm-miR319a在正常雌蕊與褐化雌蕊表達(dá)量無明顯差異,Pm-TCP4在褐化雌蕊中表達(dá)量高于正常雌蕊,說明Pm-CP4可能與雌蕊褐化的發(fā)生有關(guān),進(jìn)而影響梅花發(fā)生敗育。對Pm-TCP4轉(zhuǎn)錄因子的下游基因預(yù)測,發(fā)現(xiàn)16個(gè)與花發(fā)育相關(guān)的基因,包含PmARF基因家族、PmCUC基因家族、PmCCoAMT基因、PmLOX2基因和PmARG7。Pm-TCP4可能通過它們影響雌蕊的發(fā)育。綜上所述,Pm-miR319a通過調(diào)節(jié)其靶基因Pm-TCP4,間接調(diào)控雌蕊的發(fā)育。
【學(xué)位單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S662.4
【部分圖文】：

Ｆｉｇｕｒｅ?２－１?Ｆｌｏｗｅｒ?ｂｕｄ?ＤＮＡ?ｏｆ?‘Ｄａｑｉｉａｎｄｉ’??以‘大嵌蒂’花芽ＤＮＡ為模板，以ｊＰｗ－ｍｉＲＳＩＱａＦ和ＰｗｍｉＲ３１９ａＲ為上下游引物，進(jìn)??行ＰＣＲ擴(kuò)增得到了７７１ｂｐ的特異性條帶（圖２－２）。將獲得的特異性片段進(jìn)行切膠回收、??連接、轉(zhuǎn)化、陽性克隆篩選和菌液ＰＣＲ檢測，送５個(gè)陽性菌液公司測序，５個(gè)測序結(jié)果??相同。分析測序結(jié)果，表明‘大嵌蒂’中獲得的Ｐｗ－ｍｉＲ３１９ａ前體片段為２２９ｂｐ，包含??于７７１ｂｐ當(dāng)中。但在序列中部分ｍｉＲＮＡｓ前體的堿基序列與基因組中序列略有不同，但??對其二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成不造成根本影響，其二級(jí)結(jié)構(gòu)的自由能也變化不大。??Ｉ??圖?２－２?Ｐｗ－ｍｉＲ３１９ａ?前體?ＤＮＡ?片段??Ｆｉｇ?２－２?Ｐｗ－ｍｉＲ３１９ａ?ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ?ＤＮＡ?ｆｒａｇｍｅｎｔ??２．２梅Ｐｍ－ｍｉＲＪＩＱａ前體序列折疊??已知／Ｖｗ－ｍｉＲ３１９ａ的前體序列運(yùn)用在線ＲＮＡ?Ｆｏｌｄｉｎｇ?Ｆｏｒｍ??（ｈｔｔｐ：／／ｍｆｏｌｄ．ｍａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／？ｑ＝ｍｆｏｌｄ／ＲＮＡ－Ｆｏｌｄｉｎｇ－Ｆｏｒｍ?）對前體進(jìn)行折疊

列經(jīng)過兩次剪切并運(yùn)輸加工，才形成了成熟的ｍｉＲＮＡ。對ｎｉｉＲ３１９ａ進(jìn)行多序列比對分析，??結(jié)果顯示他們前體序列的發(fā)卡結(jié)構(gòu)處和成熟體區(qū)域顯示出較高的保守性，其他區(qū)域的保守??性不高（圖２－６）。對２０個(gè)物種ｍｉＲ３１９ａ前體序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，可以幫助我們從ｍｉＲＮＡ??前體結(jié)構(gòu)了解到不同物種間的進(jìn)化關(guān)系。運(yùn)用ＭＥＧＡ６軟件構(gòu)建進(jìn)化樹（圖２－７），通過觀??察系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)２０個(gè)物種ｍｉＲ３１９ａ前體序列的進(jìn)化樹分為兩大分支，第－分支含有１０個(gè)??物種，第二分支也侖１０個(gè)物種。其中梅和桃親緣關(guān)系最近，其次是玉米和苜蓿，香瓜和蓖??麻。蘋果與香瓜、蓖麻和無油樟親緣關(guān)系較近與擬南芥親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這些都說明了??ｍｉＲ３１９ａ在進(jìn)化關(guān)系上具有種間差異性。??２７??

、．：Ｉ??Ｂ?？?＾??＾?，—＇、、??圖３－１?‘大嵌蒂’花芽總ＲＮＡ提取??Ｆｉｇｕｒｅ?３－１?Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｆｒｏｍ?ｆｌｏｗｅｒ?ｂｕｄｓ??２．２靶基因克隆及序列分析??根據(jù)預(yù)測的靶基因Ｐｍ－ｒｃ／＾序列分析，設(shè)計(jì)含有開放閱讀框（ＯＲＦ）的特異引物，??以梅品種‘大嵌蒂’?ＣＤＮＡ為模板，進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，將獲得的特異片段進(jìn)行切膠回收、??連接、轉(zhuǎn)化、篩選陽性克隆和ＰＣＲ檢測，５個(gè)陽性菌液公司測序，５個(gè)測序結(jié)果相同（圖??３－２）。測序結(jié)果去掉非編碼序列，顯示靶基因片段大小為１３２０ｂｐ?（圖３－３），編碼４３９??個(gè)氨基酸，與梅基因組上預(yù)測的序列相似度９９．０９％。分析結(jié)果顯示，Ｐｗ－７ｒ７＾序列包??含完整的開放式閱讀框，以ＡＴＧ為起始密碼子，以ＴＡＡ為終止密碼子。??＼｜：＜１００??圖３－２尸／７７－ＴＴ／Ｖ基因ｃＤＮＡ片段??Ｆｉｇｕｒｅ?３－２?Ｐｍ－ＴＣＰ４?ｇｅｎｅ?ｃＤＮＡ?ｆｒ

本文編號(hào)：2884954