VaWRKY12和VaWRKY14調(diào)控山葡萄低溫或干旱應(yīng)答的機(jī)理研究

發(fā)布時(shí)間：2020-11-19 17:38

　　葡萄(Vitis vinifera L.)是世界范圍內(nèi)一種重要的果樹作物。我國北方葡萄主產(chǎn)區(qū)冬季寒冷干旱,主栽的歐亞種抗寒旱性較差,需要埋土才能安全越冬。此外,晚霜或早霜等低溫引起的冷害和凍害也造成葡萄新芽和嫩枝的傷害,從而影響葡萄果實(shí)的品質(zhì)與產(chǎn)量。因此,深入研究葡萄抗寒旱的分子機(jī)理,對培育抗寒旱的葡萄新品種,具有重要的理論和實(shí)際意義。前期研究發(fā)現(xiàn),葡萄中多個(gè)WRKY基因能夠快速響應(yīng)低溫脅迫,表明它們可能參與了葡萄的抗寒調(diào)控。本研究以高抗的山葡萄為材料,克隆了VaWRKY12,對其在不同脅迫條件下的表達(dá)模式及亞細(xì)胞定位進(jìn)行了分析,并通過在擬南芥和山葡萄愈傷組織中過表達(dá)VaWRKY12,對其抗性功能及可能調(diào)控的下游基因進(jìn)行了研究。同時(shí),通過構(gòu)建酵母雙雜交文庫篩選可能與VaWRKY12互作的蛋白。此外,本研究同時(shí)克隆了VaWRKY14基因,分析了其在不同脅迫下的表達(dá)模式與亞細(xì)細(xì)胞定位,并通過在擬南芥中過表達(dá)VaWRKY14分析其抗性功能及下游調(diào)控。取得的主要研究結(jié)果如下:1、在山葡萄中克隆了VaWRKY12基因,序列分析結(jié)果顯示VaWRKY12蛋白含有一個(gè)完整的WRKY結(jié)構(gòu)域,其C端含有一個(gè)C_2H_2鋅指結(jié)構(gòu),屬于WRKY IIb亞家族。VaWRKY12能夠響應(yīng)低溫脅迫,隨著冷處理時(shí)間的延長表達(dá)量持續(xù)上調(diào),同時(shí)VaWRKY12能夠不同程度地響應(yīng)外源ABA、SA和GA的處理。2、VaWRKY12蛋白序列C端含有一段跨膜區(qū)(TM)。利用擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)進(jìn)行研究表明,正常條件下VaWRKY12全長蛋白同時(shí)分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核,在低溫及其他脅迫條件下全部定位在細(xì)胞核,而去掉TM區(qū)的VaWRKY12截短蛋白在正常條件下全部定位于細(xì)胞核。由此可以推論,TM區(qū)影響VaWRKY12在細(xì)胞內(nèi)的定位,脅迫后VaWRKY12可能會(huì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移。3、構(gòu)建了基于35S啟動(dòng)子的VaWRKY12過表達(dá)載體,過表達(dá)VaWRKY12后擬南芥植株的抗寒性顯著高于野生型。低溫條件下過表達(dá)VaWRKY12能夠提高植株中SOD的酶活,降低體內(nèi)活性氧H_2O_2和O_2~-的積累,表明VaWRKY12通過增加植株的抗氧化能力來增強(qiáng)植物的抗寒性。4、過表達(dá)VaWRKY12的山葡萄愈傷其抗寒性顯著高于空載對照。低溫處理下過表達(dá)VaWRKY12愈傷中大量與脅迫相關(guān)的基因上調(diào)表達(dá),其中包括ROS清除相關(guān)的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)基因和POD基因。這些結(jié)果表明VaWRKY12可能通過影響ROS的清除來調(diào)控葡萄的抗寒性。5、以VaWRKY12為誘餌蛋白進(jìn)行互作蛋白的篩選,共得到10個(gè)候選的互作蛋白,其中包括2個(gè)泛素相關(guān)蛋白和2個(gè)鈣調(diào)結(jié)合蛋白,這些蛋白可能通過與VaWRKY12的相互作用來調(diào)控葡萄的抗寒性。6、VaWRKY14基因序列分析結(jié)果表明VaWRKY14屬于WRKY IIa亞家族基因。擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)VaWRKY14蛋白定位在細(xì)胞核。VaWRKY14能夠響應(yīng)低溫和干旱脅迫及外源SA和ABA的處理。過表達(dá)VaWRKY14能夠顯著提高擬南芥的抗旱性。同時(shí),過表達(dá)VaWRKY14擬南芥在干旱條件下抗氧化活性(CAT、POD和SOD)高于野生型植株。RNA-Seq結(jié)果顯示過表達(dá)VaWRKY14后擬南芥中大量與脅迫相關(guān)基因的表達(dá)量上調(diào)。
【學(xué)位單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院武漢植物園)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S663.1
【部分圖文】：