發(fā)布時間：2020-11-19 23:37

　　 自交不親和(Self-Incompatibility,SI)是普遍存在顯花植物中防止近親繁殖、促進遺傳變異一種典型機制。梨(Pyrus)屬于薔薇科的蘋果亞科,是我國重要的經濟果樹,其坐果結實受到配子體型自交不親和(Gametophytic Self-Incompatibility,GSI)的調控。自花授粉后,受花柱S-RNase影響,花粉管僅能生長至花柱的1/3處,無法完成授粉授精過程,導致結果率很低。GSI由SI雌蕊決定因子S-RNase控制。S-RNase已經被證實可以編碼RNase蛋白,該蛋白具有與細胞毒素相似的功能,可以特異性的抑制自我花粉管的生長,阻止近親繁衍。SFBBs是候選SI花粉決定因子,其具有F-box結構域,可以通過形成SCF復合體降解S-RNase蛋白,促進異花授粉結實。目前的研究表明,S位點中一般包含多個花粉SFBBs基因,例如S4位點分離出6個花粉SFBBs基因,S2位點分離出10個花粉SFBBs基因。目前,在鴨梨S21與S34中僅分別報道了 3個和4個花粉SFBBs基因,還有諸多未知的花粉SFBB基因等待發(fā)現(xiàn)。另外,S-RNase作用機制還不清楚,而原核表達純化S-RNase可以加速相關研究進展。本文采用體外表達技術,純化出鴨梨的兩種S-RNase,并分析了這兩種重組S-RNase對花粉管生長的影響。另外,我們通過構建基因組文庫的方式,在鴨梨的S位點挖掘未知的鴨梨SFBBs基因。主要結果如下:1.確認體外表達S-RNase抑制花粉管生長。原核表達的S-RNase蛋白具備與花柱S-RNase蛋白一樣的功能,可以抑制花粉管生長。添加重組蛋白培養(yǎng)4 h后,均與對照組存在顯著性差異。添加單種重組蛋白,其花粉管長度約為對照的一半,而添加兩種重組蛋白的花粉管長度為對照組的1/3。2.篩選出重組S-RNase調控的基因。在重組蛋白處理的花粉轉錄數(shù)據(jù)中,共發(fā)現(xiàn)14個差異基因。這些基因的功能主要包括碳水化合物的運輸和新陳代謝、翻譯后修飾,復制,重組和修復、翻譯后修飾,蛋白質周轉和伴侶蛋白、無機離子轉運和代謝、胞內運輸分泌和囊泡運輸。其中發(fā)現(xiàn)三個可能與ROS產生相關的上調基因(Pbr028631、Pbr03131P和Pr034143)和一個可能參與S-RNase在體內轉運的下調基因(Pbr039542)。3.篩選出6個新的SFBBs基因。從構建的基因組文庫中找到7個在花粉中均有高量表達的F-box基因。序列對比與聚類分析的結果顯示,其中有6個F-box基因可能為SSFBB基因,而Pbr037090的表達量低于各個基因,且其含有一段其他SFBB價沒有的核苷酸序列,推測其可能不是SFBBs基因,可能為SLFL。
【學位單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S661.2
【部分圖文】：

．以鴨梨花柱ｃＤＮＡ為模板，分別擴增了幻（ＡＹ２５０９８９．３?）和??（ＤＱ４１４８１３．１）的ＣＤＳ區(qū)域。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，兩個基因的大小在７５０ｂｐ附近，??合預期大小，且均為單一特異性條帶（圖３－１）。將兩個條帶分別回收純化之后，與載體??粒ｐＣｏｌｄ－ＴＦ同時進行雙酶切并分別回收純化片段。將目的片段分別與ｐＣｏｌｄ－ＴＦ載體連??轉化后，在Ａｍｐ抗性平板上挑選菌落。每個重組質粒挑選單克隆進行驗證，其中空載菌??約為２５０?ｂｐ，而正確連接的單克隆約為１?ｋｂ左右。如圖３．１所示，幻Ｍ此的重組質??中共有３個陽性克隆，幻的重組質粒有４個陽性克隆。??為了避免假陽性，分別挑選兩個陽性克隆過夜搖菌，提取質粒后進行雙酶切驗證，以??Ｃｏｌｄ－ＴＦ環(huán)狀質粒作陽性對照。凝膠圖約為５．８?ｋｂ位置為酶切過的載體質粒，７５０?ｂｐ附近??目的條帶大小。四個質粒都切出了兩個條帶，上方條帶與質粒ＤＮＡ大小相當，下方條??大小與ＰＣＲ產物大小相一致，說明這些質粒都已經被正確構建。將篩選的陽性克隆送至??工生物公司進行ｓａｎｇｅｒ測序，測序結果經過對比，與ＮＣＢ丨中登陸的幻的??ＤＳ區(qū)域完全匹配，可以進行下一步的原核表達。??

２５０ｂｐ??（ｃ）??圖２．１?５２１－ＲＮａｓｅ和Ｓ３４－ＲＮａｓｅ的重組質粒構建??（ａ）：?６２１／５３４－ＲＮａｓｅＣＤＳ區(qū)域ＰＣＲ產物；（ｂ）：重組質粒的酶切鑒定；（ｃ）：重組質粒的ＰＣＲ篩選。??Ｍ：?ＭａｒｋｅｒＤ２０００?（Ｔｉａｎｇｅｎ）；?Ｓ２１：?Ｓ２１－ＲＮａｓｅ；?Ｓ３４：?Ｓ３４－ＲＮａｓｅ??Ｆｉｇｕｒｅ?２．１?Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄｓ?ｆｏｒ?．Ｓ２１－ＲＮａｓｅ?ａｎｄ?５３４－ＲＮａｓｅ．?（ａ）：?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ｏｆ??Ｓ２１－ＲＮａｓｅ?ａｎｄ?Ｓ３４－ＲＮａｓｅ?ＣＤＳ?ｒｅｇｉｏｎｓ；?（ｂ）：?ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ?ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄｓ；?（ｃ）：?ＰＣＲ??ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄｓ．?Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ?Ｄ２０００?（Ｔｉａｎｇｅｎ）；?Ｓ２１：?Ｓ２１－ＲＮａｓｅ；?３４：?Ｓ３４－ＲＮａｓｅ??

然后使用４０?ｍＭ濃度的咪唑對非特異性吸附的雜蛋白進行洗滌，并使用２５０??ｍＭ濃度的咪唑進行洗脫收集。??從圖２．４中可以看出，泳道１和２以及泳道４和５中的蛋白雜帶很多，雖然含有一定??量的目的蛋白，但從洗脫的情況（泳道３和泳道６）來看，目的條帶較為清晰明亮，且雜??蛋白濃度遠遠低于目的蛋白�？蓪⑾疵摰牡鞍走M行脫鹽、濃縮，并用甘油保存重組ｇＲＮａｓｅ??蛋白。??
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本文編號：2890599