發(fā)布時(shí)間：2020-11-19 23:37

　　 自交不親和(Self-Incompatibility,SI)是普遍存在顯花植物中防止近親繁殖、促進(jìn)遺傳變異一種典型機(jī)制。梨(Pyrus)屬于薔薇科的蘋果亞科,是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)果樹,其坐果結(jié)實(shí)受到配子體型自交不親和(Gametophytic Self-Incompatibility,GSI)的調(diào)控。自花授粉后,受花柱S-RNase影響,花粉管僅能生長(zhǎng)至花柱的1/3處,無(wú)法完成授粉授精過程,導(dǎo)致結(jié)果率很低。GSI由SI雌蕊決定因子S-RNase控制。S-RNase已經(jīng)被證實(shí)可以編碼RNase蛋白,該蛋白具有與細(xì)胞毒素相似的功能,可以特異性的抑制自我花粉管的生長(zhǎng),阻止近親繁衍。SFBBs是候選SI花粉決定因子,其具有F-box結(jié)構(gòu)域,可以通過形成SCF復(fù)合體降解S-RNase蛋白,促進(jìn)異花授粉結(jié)實(shí)。目前的研究表明,S位點(diǎn)中一般包含多個(gè)花粉SFBBs基因,例如S4位點(diǎn)分離出6個(gè)花粉SFBBs基因,S2位點(diǎn)分離出10個(gè)花粉SFBBs基因。目前,在鴨梨S21與S34中僅分別報(bào)道了 3個(gè)和4個(gè)花粉SFBBs基因,還有諸多未知的花粉SFBB基因等待發(fā)現(xiàn)。另外,S-RNase作用機(jī)制還不清楚,而原核表達(dá)純化S-RNase可以加速相關(guān)研究進(jìn)展。本文采用體外表達(dá)技術(shù),純化出鴨梨的兩種S-RNase,并分析了這兩種重組S-RNase對(duì)花粉管生長(zhǎng)的影響。另外,我們通過構(gòu)建基因組文庫(kù)的方式,在鴨梨的S位點(diǎn)挖掘未知的鴨梨SFBBs基因。主要結(jié)果如下:1.確認(rèn)體外表達(dá)S-RNase抑制花粉管生長(zhǎng)。原核表達(dá)的S-RNase蛋白具備與花柱S-RNase蛋白一樣的功能,可以抑制花粉管生長(zhǎng)。添加重組蛋白培養(yǎng)4 h后,均與對(duì)照組存在顯著性差異。添加單種重組蛋白,其花粉管長(zhǎng)度約為對(duì)照的一半,而添加兩種重組蛋白的花粉管長(zhǎng)度為對(duì)照組的1/3。2.篩選出重組S-RNase調(diào)控的基因。在重組蛋白處理的花粉轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)中,共發(fā)現(xiàn)14個(gè)差異基因。這些基因的功能主要包括碳水化合物的運(yùn)輸和新陳代謝、翻譯后修飾,復(fù)制,重組和修復(fù)、翻譯后修飾,蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)和伴侶蛋白、無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、胞內(nèi)運(yùn)輸分泌和囊泡運(yùn)輸。其中發(fā)現(xiàn)三個(gè)可能與ROS產(chǎn)生相關(guān)的上調(diào)基因(Pbr028631、Pbr03131P和Pr034143)和一個(gè)可能參與S-RNase在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的下調(diào)基因(Pbr039542)。3.篩選出6個(gè)新的SFBBs基因。從構(gòu)建的基因組文庫(kù)中找到7個(gè)在花粉中均有高量表達(dá)的F-box基因。序列對(duì)比與聚類分析的結(jié)果顯示,其中有6個(gè)F-box基因可能為SSFBB基因,而Pbr037090的表達(dá)量低于各個(gè)基因,且其含有一段其他SFBB價(jià)沒有的核苷酸序列,推測(cè)其可能不是SFBBs基因,可能為SLFL。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S661.2
【部分圖文】：

．以鴨梨花柱ｃＤＮＡ為模板，分別擴(kuò)增了幻（ＡＹ２５０９８９．３?）和??（ＤＱ４１４８１３．１）的ＣＤＳ區(qū)域。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，兩個(gè)基因的大小在７５０ｂｐ附近，??合預(yù)期大小，且均為單一特異性條帶（圖３－１）。將兩個(gè)條帶分別回收純化之后，與載體??粒ｐＣｏｌｄ－ＴＦ同時(shí)進(jìn)行雙酶切并分別回收純化片段。將目的片段分別與ｐＣｏｌｄ－ＴＦ載體連??轉(zhuǎn)化后，在Ａｍｐ抗性平板上挑選菌落。每個(gè)重組質(zhì)粒挑選單克隆進(jìn)行驗(yàn)證，其中空載菌??約為２５０?ｂｐ，而正確連接的單克隆約為１?ｋｂ左右。如圖３．１所示，幻Ｍ此的重組質(zhì)??中共有３個(gè)陽(yáng)性克隆，幻的重組質(zhì)粒有４個(gè)陽(yáng)性克隆。??為了避免假陽(yáng)性，分別挑選兩個(gè)陽(yáng)性克隆過夜搖菌，提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，以??Ｃｏｌｄ－ＴＦ環(huán)狀質(zhì)粒作陽(yáng)性對(duì)照。凝膠圖約為５．８?ｋｂ位置為酶切過的載體質(zhì)粒，７５０?ｂｐ附近??目的條帶大小。四個(gè)質(zhì)粒都切出了兩個(gè)條帶，上方條帶與質(zhì)粒ＤＮＡ大小相當(dāng)，下方條??大小與ＰＣＲ產(chǎn)物大小相一致，說明這些質(zhì)粒都已經(jīng)被正確構(gòu)建。將篩選的陽(yáng)性克隆送至??工生物公司進(jìn)行ｓａｎｇｅｒ測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過對(duì)比，與ＮＣＢ丨中登陸的幻的??ＤＳ區(qū)域完全匹配，可以進(jìn)行下一步的原核表達(dá)。??

２５０ｂｐ??（ｃ）??圖２．１?５２１－ＲＮａｓｅ和Ｓ３４－ＲＮａｓｅ的重組質(zhì)粒構(gòu)建??（ａ）：?６２１／５３４－ＲＮａｓｅＣＤＳ區(qū)域ＰＣＲ產(chǎn)物；（ｂ）：重組質(zhì)粒的酶切鑒定；（ｃ）：重組質(zhì)粒的ＰＣＲ篩選。??Ｍ：?ＭａｒｋｅｒＤ２０００?（Ｔｉａｎｇｅｎ）；?Ｓ２１：?Ｓ２１－ＲＮａｓｅ；?Ｓ３４：?Ｓ３４－ＲＮａｓｅ??Ｆｉｇｕｒｅ?２．１?Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄｓ?ｆｏｒ?．Ｓ２１－ＲＮａｓｅ?ａｎｄ?５３４－ＲＮａｓｅ．?（ａ）：?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ｏｆ??Ｓ２１－ＲＮａｓｅ?ａｎｄ?Ｓ３４－ＲＮａｓｅ?ＣＤＳ?ｒｅｇｉｏｎｓ；?（ｂ）：?ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ?ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄｓ；?（ｃ）：?ＰＣＲ??ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄｓ．?Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ?Ｄ２０００?（Ｔｉａｎｇｅｎ）；?Ｓ２１：?Ｓ２１－ＲＮａｓｅ；?３４：?Ｓ３４－ＲＮａｓｅ??

然后使用４０?ｍＭ濃度的咪唑?qū)Ψ翘禺愋晕�附的雜蛋白進(jìn)行洗滌，并使用２５０??ｍＭ濃度的咪唑進(jìn)行洗脫收集。??從圖２．４中可以看出，泳道１和２以及泳道４和５中的蛋白雜帶很多，雖然含有一定??量的目的蛋白，但從洗脫的情況（泳道３和泳道６）來(lái)看，目的條帶較為清晰明亮，且雜??蛋白濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于目的蛋白。可將洗脫的蛋白進(jìn)行脫鹽、濃縮，并用甘油保存重組ｇＲＮａｓｅ??蛋白。??
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