馬藺重金屬ATP酶基因HMA2的克隆及其RNAi遺傳轉化研究
發(fā)布時間：2020-12-17 12:12
馬藺（Iris lactea）又名馬蓮,是鳶尾科鳶尾屬多年生的宿根草本植物,廣泛分布于全國各地。其根系十分發(fā)達、長勢旺盛、對環(huán)境適應性強是耐重金屬、抗旱、耐鹽堿的優(yōu)良觀賞地被植物。本研究以馬藺為研究材料,擬采用RACE技術獲得HMA2全長cDNA序列;利用原子吸收分光光度計和Real-time RT-PCR技術分別對不同濃度CdC12· 2.5H2O處理下其根及地上部的HMA2表達水平及Cd2+積累模式與變化規(guī)律進行分析;揭示其在低鎘（25 mg L-1 CdC12·2.5H20）或高鎘（150 mg L-1 CdC12.2.5H2O）處理不同時間（0-168 h）下馬藺IlHMA2表達模式時空變化規(guī)律。以馬藺根中總RNA為模板,采用RT-PCR方法獲得了重金屬ATP酶基因片段,以中間載體pHANNIBAL和植物表達載體pART27為基礎,采用酶切和連接的方法,構建了 CaMV35S啟動子驅動含有目的基因IlHMA2片段的反向重復序列表達載體pARTG1G2,并使用農桿菌介導將此重組質粒整合入農桿菌GV3101,并轉入到馬藺幼苗體內獲得了I萬HMA2-RNAi轉化株系。研究結果將為闡明...
【文章來源】：山西農業(yè)大學山西省
【文章頁數(shù)】：50 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
圖３．］馬藺總ＲＮＡ的凝膠電泳??
上下無雜帶與目的片段一致（圖３．２）。經(jīng)測序得到??序列長度為２６５?ｂｐ。??Ｍｌ?１??■｜??（＆???２５０＾，?ＫＳＫＳｉ?２６５ｂＰ??Ｉ?ｆ?１?ｎｐ??圖３．２?／／Ｍ４２核心片段的ＰＣＲ凝膠電泳??Ｆｉｇ．?３．２?Ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＨＭＡ２?ｃｏｒｅ?ｆｒａｇｍｅｎｔ??注：１：／／Ｍ４２片段ＰＣＲ產(chǎn)物。??Ｎｏｔｅ：?１：?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＨＭＡ２?ｆｒａｇｍｅｎｔ．??３．３?基因的３’ＲＡＣＥ擴增結果??以馬藺的３’ＲＡＣＥ得到的ｃＤＮＡ為模板，用３’ＨＭＡ２?ＷＦ１與３＇ＨＭＡ２ＮＦ］引物進??行ＰＣＲ擴增，經(jīng)凝膠電泳檢測可知其外側ＰＣＲ產(chǎn)物并未出現(xiàn)目的條帶，而通過內側ＰＣＲ??得到約為３０００?ｂｐ的ＤＮＡ目的擴增產(chǎn)物（圖３．３?），經(jīng)測序長度為２８９８?ｂｐ。??Ｍ２?１??５０００ｂｐ?ＫｊＫ－４?ｉ??一２８９８ｂｐ??１０００ｂｐ???７５０ｂｐ?——??５〇〇ｂｐ—－－—??２５０ｂｐ???ｌＯＯｂｐ???圖３．３?３’ＲＡＣＥ?ＰＣＲ的凝膠電泳??Ｆｉｇ．?３．３?Ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?３’ＲＡＣＥ??注：１：３’ＲＡＣＥＰＣＲ?產(chǎn)物。??Ｎｏｔｅ：?１：?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?３，ＲＡＣＥ??３．４?／／Ｍ４２基因的５＿ＲＡＣＥ擴增結果??以馬藺５’ＲＡＣＥ得到的ｃＤＮＡ為模板，使用５＇ＨＭＡ２?ＷＲ１與５’ＨＭＡ２ＮＦ１引物進??行巢式ＰＣＲ。經(jīng)凝膠電泳檢測
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【參考文獻】：
期刊論文
[1]馬藺VP基因的克隆與植物表達載體構建[J]. 郭靜雅,李杉杉,郭強,毛培春,田小霞,孟林,楊曉盆. 分子植物育種. 2016(12)
[2]鹽生植物小花堿茅外整流K+通道PtSKOR基因的克隆及RNAi載體構建[J]. 段麗婕,王沛,陳夢詞,王鎖民. 分子植物育種. 2015(04)
[3]無芒隱子草CsLEA基因超表達載體和反義表達載體構建[J]. 段珍,狄紅艷,張吉宇,霍雅馨,孔令芳. 草業(yè)科學. 2014(08)
[4]水稻P1B型ATPase重金屬轉運蛋白的結構與功能研究進展[J]. 鐘茜,李韶山. 寧夏師范學院學報. 2013(06)
[5]植物hpRNA干擾載體構建的研究進展[J]. 言普,沈文濤,黎小瑛,周鵬. 生物技術通報. 2013(09)
[6]RNAi機制及在植物中應用的研究概述[J]. 崔喜艷,孫小杰,劉忠野,張繼偉. 吉林農業(yè)大學學報. 2013(02)
[7]重金屬污染土壤修復技術及其修復實踐[J]. 黃益宗,郝曉偉,雷鳴,鐵柏清. 農業(yè)環(huán)境科學學報. 2013(03)
[8]馬藺對鉛尾砂土壤酶活性和鉛形態(tài)的影響[J]. 原海燕,佟海英,黃蘇珍. 生態(tài)環(huán)境學報. 2012(11)
[9]多漿旱生植物霸王質膜Na+/H+逆向轉運蛋白基因RNAi載體構建[J]. 馬清,王鎖民. 草業(yè)科學. 2012(04)
[10]湘江流域土壤重金屬污染及其生態(tài)環(huán)境風險評價[J]. 劉春早,黃益宗,雷鳴,郝曉偉,李希,鐵柏清,謝建治. 環(huán)境科學. 2012(01)
博士論文
[1]東南景天鎘超積累相關基因的克隆與功能研究[D]. 張敏.浙江大學 2011
碩士論文
[1]長穗偃麥草高親和K+轉運蛋白基因EeHKT1;4的克隆及對煙草遺傳轉化研究[D]. 張琳.山西農業(yè)大學 2015
[2]鳶尾屬（Iris L.）4種植物鎘（Cd）積累、耐性機理及影響因子研究[D]. 原海燕.南京農業(yè)大學 2006
本文編號：2922020
【文章來源】：山西農業(yè)大學山西省
【文章頁數(shù)】：50 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
圖３．］馬藺總ＲＮＡ的凝膠電泳??
上下無雜帶與目的片段一致（圖３．２）。經(jīng)測序得到??序列長度為２６５?ｂｐ。??Ｍｌ?１??■｜??（＆???２５０＾，?ＫＳＫＳｉ?２６５ｂＰ??Ｉ?ｆ?１?ｎｐ??圖３．２?／／Ｍ４２核心片段的ＰＣＲ凝膠電泳??Ｆｉｇ．?３．２?Ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＨＭＡ２?ｃｏｒｅ?ｆｒａｇｍｅｎｔ??注：１：／／Ｍ４２片段ＰＣＲ產(chǎn)物。??Ｎｏｔｅ：?１：?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＨＭＡ２?ｆｒａｇｍｅｎｔ．??３．３?基因的３’ＲＡＣＥ擴增結果??以馬藺的３’ＲＡＣＥ得到的ｃＤＮＡ為模板，用３’ＨＭＡ２?ＷＦ１與３＇ＨＭＡ２ＮＦ］引物進??行ＰＣＲ擴增，經(jīng)凝膠電泳檢測可知其外側ＰＣＲ產(chǎn)物并未出現(xiàn)目的條帶，而通過內側ＰＣＲ??得到約為３０００?ｂｐ的ＤＮＡ目的擴增產(chǎn)物（圖３．３?），經(jīng)測序長度為２８９８?ｂｐ。??Ｍ２?１??５０００ｂｐ?ＫｊＫ－４?ｉ??一２８９８ｂｐ??１０００ｂｐ???７５０ｂｐ?——??５〇〇ｂｐ—－－—??２５０ｂｐ???ｌＯＯｂｐ???圖３．３?３’ＲＡＣＥ?ＰＣＲ的凝膠電泳??Ｆｉｇ．?３．３?Ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?３’ＲＡＣＥ??注：１：３’ＲＡＣＥＰＣＲ?產(chǎn)物。??Ｎｏｔｅ：?１：?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?３，ＲＡＣＥ??３．４?／／Ｍ４２基因的５＿ＲＡＣＥ擴增結果??以馬藺５’ＲＡＣＥ得到的ｃＤＮＡ為模板，使用５＇ＨＭＡ２?ＷＲ１與５’ＨＭＡ２ＮＦ１引物進??行巢式ＰＣＲ。經(jīng)凝膠電泳檢測
上下無雜帶與目的片段一致（圖３．２）。經(jīng)測序得到??序列長度為２６５?ｂｐ。??Ｍｌ?１??■｜??（＆???２５０＾，?ＫＳＫＳｉ?２６５ｂＰ??Ｉ?ｆ?１?ｎｐ??圖３．２?／／Ｍ４２核心片段的ＰＣＲ凝膠電泳??Ｆｉｇ．?３．２?Ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＨＭＡ２?ｃｏｒｅ?ｆｒａｇｍｅｎｔ??注：１：／／Ｍ４２片段ＰＣＲ產(chǎn)物。??Ｎｏｔｅ：?１：?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＨＭＡ２?ｆｒａｇｍｅｎｔ．??３．３?基因的３’ＲＡＣＥ擴增結果??以馬藺的３’ＲＡＣＥ得到的ｃＤＮＡ為模板，用３’ＨＭＡ２?ＷＦ１與３＇ＨＭＡ２ＮＦ］引物進??行ＰＣＲ擴增，經(jīng)凝膠電泳檢測可知其外側ＰＣＲ產(chǎn)物并未出現(xiàn)目的條帶，而通過內側ＰＣＲ??得到約為３０００?ｂｐ的ＤＮＡ目的擴增產(chǎn)物（圖３．３?），經(jīng)測序長度為２８９８?ｂｐ。??Ｍ２?１??５０００ｂｐ?ＫｊＫ－４?ｉ??一２８９８ｂｐ??１０００ｂｐ???７５０ｂｐ?——??５〇〇ｂｐ—－－—??２５０ｂｐ???ｌＯＯｂｐ???圖３．３?３’ＲＡＣＥ?ＰＣＲ的凝膠電泳??Ｆｉｇ．?３．３?Ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?３’ＲＡＣＥ??注：１：３’ＲＡＣＥＰＣＲ?產(chǎn)物。??Ｎｏｔｅ：?１：?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?３，ＲＡＣＥ??３．４?／／Ｍ４２基因的５＿ＲＡＣＥ擴增結果??以馬藺５’ＲＡＣＥ得到的ｃＤＮＡ為模板，使用５＇ＨＭＡ２?ＷＲ１與５’ＨＭＡ２ＮＦ１引物進??行巢式ＰＣＲ。經(jīng)凝膠電泳檢測
【參考文獻】：
期刊論文
[1]馬藺VP基因的克隆與植物表達載體構建[J]. 郭靜雅,李杉杉,郭強,毛培春,田小霞,孟林,楊曉盆. 分子植物育種. 2016(12)
[2]鹽生植物小花堿茅外整流K+通道PtSKOR基因的克隆及RNAi載體構建[J]. 段麗婕,王沛,陳夢詞,王鎖民. 分子植物育種. 2015(04)
[3]無芒隱子草CsLEA基因超表達載體和反義表達載體構建[J]. 段珍,狄紅艷,張吉宇,霍雅馨,孔令芳. 草業(yè)科學. 2014(08)
[4]水稻P1B型ATPase重金屬轉運蛋白的結構與功能研究進展[J]. 鐘茜,李韶山. 寧夏師范學院學報. 2013(06)
[5]植物hpRNA干擾載體構建的研究進展[J]. 言普,沈文濤,黎小瑛,周鵬. 生物技術通報. 2013(09)
[6]RNAi機制及在植物中應用的研究概述[J]. 崔喜艷,孫小杰,劉忠野,張繼偉. 吉林農業(yè)大學學報. 2013(02)
[7]重金屬污染土壤修復技術及其修復實踐[J]. 黃益宗,郝曉偉,雷鳴,鐵柏清. 農業(yè)環(huán)境科學學報. 2013(03)
[8]馬藺對鉛尾砂土壤酶活性和鉛形態(tài)的影響[J]. 原海燕,佟海英,黃蘇珍. 生態(tài)環(huán)境學報. 2012(11)
[9]多漿旱生植物霸王質膜Na+/H+逆向轉運蛋白基因RNAi載體構建[J]. 馬清,王鎖民. 草業(yè)科學. 2012(04)
[10]湘江流域土壤重金屬污染及其生態(tài)環(huán)境風險評價[J]. 劉春早,黃益宗,雷鳴,郝曉偉,李希,鐵柏清,謝建治. 環(huán)境科學. 2012(01)
博士論文
[1]東南景天鎘超積累相關基因的克隆與功能研究[D]. 張敏.浙江大學 2011
碩士論文
[1]長穗偃麥草高親和K+轉運蛋白基因EeHKT1;4的克隆及對煙草遺傳轉化研究[D]. 張琳.山西農業(yè)大學 2015
[2]鳶尾屬（Iris L.）4種植物鎘（Cd）積累、耐性機理及影響因子研究[D]. 原海燕.南京農業(yè)大學 2006
本文編號：2922020
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