發(fā)布時(shí)間：2020-11-02 15:26

　　 海洋覆蓋地球表面70%以上的面積,蘊(yùn)含著種類多樣、數(shù)量豐富的微生物。細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖是海洋中顆粒有機(jī)質(zhì)(particulate organic matter,POM)的重要組分。D型丙氨酸(D-alanine,D-Ala)是肽聚糖的關(guān)鍵組分,二氨基庚二酸(diaminopimelic acid,DAP)是革蘭氏陰性細(xì)菌肽聚糖的特征性組分。海洋環(huán)境中,微生物利用D-Ala和DAP的機(jī)制,以及能夠利用DAP細(xì)菌的種類,目前研究并不清楚。Pseudoalteromonas sp.CF6-2是本實(shí)驗(yàn)室從深海沉積物中分離得到的一株可以降解革蘭氏陽(yáng)性菌肽聚糖并能以釋放出的D-Ala為唯一氮源生長(zhǎng)的菌株。本文對(duì)推定的CF6-2利用D-Ala的代謝通路中的三個(gè)關(guān)鍵酶進(jìn)行了異源表達(dá)和純化,并對(duì)它們進(jìn)行了體外功能驗(yàn)證與表征。DAP是革蘭氏陰性細(xì)菌肽聚糖的特征性組分。本文對(duì)西太平洋多個(gè)位點(diǎn)不同深度的海水樣品中能利用DAP為唯一碳氮源的細(xì)菌進(jìn)行了多樣性分析,并從中篩選出了 45株能利用DAP的菌株;本文還分析了其中2株菌株利用DAP的代謝通路。1.深海細(xì)菌Pseudoalteromonas sp.CF6-2利用D-Ala代謝通路中關(guān)鍵酶的體外功能驗(yàn)證與表征前期研究表明,Ps.sp.CF6-2分泌的彈性蛋白酶pseudoalterin能裂解革蘭氏陽(yáng)性菌肽聚糖中D-Ala兩端的肽鍵,釋放D-Ala,并能以D-Ala為唯一氮源生長(zhǎng)�；蚪M與轉(zhuǎn)錄組分析表明,在Ps.sp.CF6-2利用D-Ala的代謝通路中,D-Ala連接酶0208、Ala消旋酶3059和D-Ala氨基轉(zhuǎn)移酶1756可能起到關(guān)鍵作用。本文對(duì)這這些酶的功能進(jìn)行了體外驗(yàn)證,并對(duì)它們進(jìn)行了表征。D-Ala對(duì)于細(xì)菌通常具有毒性。我們測(cè)定了 Ps.sp.CF6-2以不同濃度的D-Ala為唯一氮源的生長(zhǎng)情況,結(jié)果表明Ps.sp.CF6-2雖然可以利用D-Ala為唯一氮源生長(zhǎng),但高濃度的D-Ala對(duì)Ps.sp.CF6-2的生長(zhǎng)仍具有抑制作用,表明Ps.sp.CF6-2利用低濃度D-Ala時(shí)可能會(huì)先將其轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)以對(duì)抗其毒性。我們對(duì)推定的Ps.sp.CF6-2利用D-Ala的關(guān)鍵酶D-Ala連接酶0208、Ala消旋酶3059和D-Ala氨基轉(zhuǎn)移酶1756進(jìn)行了異源表達(dá)和純化,然后通過體外酶活測(cè)定實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了它們利用D-Ala的功能,證明D-Ala連接酶0208可以將D-Ala互相連接成為D-Ala-D-Ala二肽,Ala消旋酶3059可以將D-Ala和L-Ala互相轉(zhuǎn)化,D-Ala氨基轉(zhuǎn)移酶1756可以將D-Ala脫氨為丙酮酸,為推定的Ps.sp.CF6-2的D-Ala代謝通路提供了證據(jù)。我們還測(cè)定了上述酶的米氏曲線等表征。2.西太平洋水樣中利用二氨基庚二酸菌株的篩選及多樣性分析我們以DAP為唯一碳氮源,對(duì)西太平洋A1、A3、A4、A10、B3位點(diǎn)不同深度共16個(gè)海水樣品進(jìn)行了富集培養(yǎng),分析了西太平洋水樣中能利用DAP為唯一碳氮源的細(xì)菌的多樣性,發(fā)現(xiàn)西太平洋表層和淺層海水樣品中能利用DAP為唯一碳氮源的細(xì)菌以Thalassospira、Erythrobacter和Haloryionas為主,而深層海水樣品中以Alteromonas、Pseudoaltemomonas、Microbacterium、Thalassospira和Nitratireductor為主。我們使用DAP篩選平板從上述位點(diǎn)的海水樣品中篩選出了45株能利用DAP的菌株。3.西太平洋細(xì)菌利用二氨基庚二酸的代謝通路研究為了闡明海洋細(xì)菌利用DAP的機(jī)制,我們選取了2株能利用DAP為唯一碳氮源生長(zhǎng)較快的菌株,其中1株革蘭氏陽(yáng)性,1株革蘭氏陰性,對(duì)它們進(jìn)行了基因組測(cè)序。通過對(duì)它們基因組中基因注釋的分析,查閱相關(guān)的酶學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù),推測(cè)它們主要通過兩條途徑利用DAP:使用diaminopimelate decarboxylase將DAP轉(zhuǎn)化為賴氨酸,然后進(jìn)入檸檬酸循環(huán);或使用UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate--2,6-diaminopimelate ligase和UDP-N-acetylmuramoyl-tripeptide-D-alanyl-D-alanine ligase將DAP連接到連接在乙�；系亩屉纳�,生成的UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamyl-meso-2,6-diaminopimeloyl-D-alanyl-D-alanine是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁DAP型肽聚糖的重要原料,可以直接被陰性菌用于自身細(xì)胞壁肽聚糖的合成。本論文研究結(jié)果初步揭示了海洋細(xì)菌代謝D-Ala和DAP的機(jī)制,對(duì)闡明海洋中細(xì)菌驅(qū)動(dòng)的D-Ala和DAP的生物地球化學(xué)循環(huán)機(jī)制具有重要意義。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q936
【部分圖文】：

放并利用Ｄ－Ａｌａ；并通過基因組和轉(zhuǎn)錄組分析，推測(cè)出Ｄ－Ａｌａ在ｓｐ．?ＣＦ６－２??代謝通路中的關(guān)鍵酶：Ｄ－Ａｌａ連接酶０２０８、Ａｌａ消旋酶３０５９和Ｄ－Ａｌａ氨基轉(zhuǎn)移??酶１７５６?（Ｙａｎｇ，２０１７）（圖１－２）。但這些酶的活性與功能尚未驗(yàn)證。??１６??

０１２３４５６７８??Ｔｉｍｅ?（Ｄａｙ）??圖２－１以不同濃度Ｄ－Ａｌａ為唯一氮源培養(yǎng)ＣＦ６－２時(shí)的生長(zhǎng)情況。??Ｆｉｇｕｒｅ?２－１．?Ｇｒｏｗｔｈ?ｏｆ?ＣＦ６－２?ｗｉｔｈ?Ｄ－Ａｌａ?ｏｆ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ?ａｓ?ｓｏｌｅ?ｎｉｔｒｏｇｅｎ?ｓｏｕｒｃｅ．??ＣＦ６－２?ｉｎ?Ｃｏｎｔｒｏｌ??ＣＦ６－２?ｉｎ?２?ｍＭ?Ｄ－Ａｌａ??ｊ?ＪＪｇ?ＣＦ６－２?ｉｎ?４?ｍＭ?Ｄ－Ａｌａ??０１８：?ＣＦ６－２?ｉｎ?６?ｍＭ?Ｄ－Ａｌａ??ＣＦ６－２?ｉｎ?１０?ｍＭ?Ｄ－Ａｌａ??ＣＦ６－２??ＣＦ６－２?２０?ｍＭ??〇?０．０８－??〇．〇ｅ：??０．００?丄ｎ?＾???７．２?７．４?７．６?７．８?８．０??Ｔｉｍｅ?（Ｄａｙ）??圖２－２?ＣＦ６－２以不同濃度Ｄ－Ａｌａ為唯一氮源生長(zhǎng)１８４

圖２－１以不同濃度Ｄ－Ａｌａ為唯一氮源培養(yǎng)ＣＦ６－２時(shí)的生長(zhǎng)情況
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