發(fā)布時間：2020-11-05 10:42

　　 大多數動物在遇到不利的生存條件時會延遲發(fā)育并進入生長發(fā)育停滯的休眠狀態(tài),這為其生命延續(xù)提供保障。例如:北極熊、青蛙、刺猬等通過休眠過冬;海參、非洲肺魚、箭豬等通過休眠度過炎熱的夏季。本研究關注的昆蟲滯育也屬于一種休眠類型,滯育是生物體渡過周期性的不利于其生存環(huán)境條件的一種策略,它是昆蟲度過不良生活條件的一種重要的生理特性。根據昆蟲滯育發(fā)生的時間,可以將其分為以下四種類型:卵滯育(胚胎滯育)、幼蟲滯育、蛹滯育、成蟲滯育。家蠶由于其獨特的歷史文化和經濟價值,長期以來都是研究者關注的實驗模型。本研究以二化性家蠶品系Dazao為實驗對象研究家蠶胚胎滯育,二化性家蠶子代滯育受親代胚胎所處環(huán)境溫度與光照影響,25℃長光照下孵育的蠶卵化蛾后產下滯育卵,15℃黑暗下孵育的蠶卵化蛾后產下非滯育卵。家蠶滯育分子機制的研究有助于擴大蠶業(yè)生產,提高產業(yè)效率,同時在農林業(yè)害蟲防治方面具有重大意義。本研究通過不同條件下孵育的Dazao胚胎反轉期和點青期的轉錄組測序,篩選滯育相關基因,并研究這些滯育相關基因在一化和二化性家蠶胚胎期的表達模式,最后通過RNAi技術鑒定這些基因的功能。主要研究結果如下:1.Dazao胚胎反轉期和點青期的轉錄組測序分析為了研究親代胚胎是如何接受外界環(huán)境刺激,并最終影響子代滯育這一問題,我們對注定產滯育卵25℃長光照下孵育胚胎和注定產非滯育卵15℃暗光照下孵育胚胎的反轉期和點青期進行轉錄組測序。轉錄組分析結果顯示:差異基因分析在胚胎反轉期(BK25 vs BK15)鑒定到812個顯著上調表達基因,65個顯著下調表達基因;在胚胎點青期(HP25 vs HP15)鑒定到201個顯著上調表達基因,232個顯著下調表達基因。GO和KEGG分析顯示差異基因涉及Phototransduction–fly,Amino sugar and nucleotide sugar metaboli,Glycosaminoglycan degradation等代謝通路。此外,胚胎反轉期和點青期的聚類分析得到共同差異表達基因44個,包括32個共同上調表達基因和12個共同下調表達基因,這些差異基因的注釋涉及膜結構成分,催化活性,結合蛋白以及代謝進程。隨機選取16個差異表達基因,通過qRT-PCR來驗證RNA-Seq的準確性,結果顯示其中15個差異基因表達上下調與轉錄組結果一致,證明測序數據的可靠性。轉錄組測序結果分析結合前人研究,我們鑒定到七個滯育候選基因,包括三個熱激蛋白基因BGIBMGA014536,BGIBMGA014618,BGIBMGA004614;兩個節(jié)律基因BGIBMGA000486(period),BGIBMGA003345(takeout);兩個TRP家族基因BGIBMGA009272,BGIBMGA009273。2.滯育相關基因在一化和二化性品系家蠶胚胎期表達模式本實驗選取一化性家蠶品系C-4,二化性家蠶品系皓月(HY)和秋豐(QF)為實驗對象,將解除滯育的蠶卵分別在25℃光照條件下和15℃黑暗條件下孵育并取材,直至孵化。利用qRT-PCR檢測七個滯育相關基因在這三個品系家蠶胚胎期的表達模式。結果顯示,三個熱激蛋白基因BGIBMGA014536,BGIBMGA014618,BGIBMGA004614在二化性品系皓月(HY)和秋豐(QF)中具有相似的胚胎期表達模式:它們在25℃明催青和15℃暗催青兩種條件下具有顯著差異表達,表現為在15℃暗催青條件下的表達量顯著高于25℃明催青條件下的表達量,而在一化性品系C-4中沒有顯著差異;滯育相關基因BGIBMGA000486和BGIBMGA003345在二化性品系皓月(HY)和秋豐(QF)的胚胎發(fā)育中后期25℃明催青條件下的表達量顯著高于15℃暗催青條件下的表達量,而在一化性品系C-4中沒有差異;兩個TRP家族基因BGIBMGA009272,BGIBMGA009273在二化性品系皓月(HY)和秋豐(QF)中也具有相似的胚胎期表達模式,它們在胚胎發(fā)育前期25℃明催青條件下的表達量高于15℃暗催青條件下的表達量,而在一化品系C-4中沒有差異。根據這七個滯育相關基因在一化和二化性品系胚胎期的差異表達模式,我們推測這些基因可能通過調節(jié)表達量的方式參與家蠶滯育調控。節(jié)律基因和TRP家族基因在25℃明催青條件下的顯著上調表達可能是其調控家蠶滯育的原因,熱激蛋白在低溫(15℃)下的顯著上調表達可能是影響產下非滯育卵的原因。3.滯育相關基因的功能鑒定根據轉錄組的結果分析和差異基因在一化和二化性品系胚胎期的差異表達模式,我們推測節(jié)律基因BGIBMGA000486(period),BGIBMGA003345(takeout);TRP家族基因BGIBMGA009272,BGIBMGA009273在25℃明催青條件下的顯著上調表達可能是其調控家蠶滯育的原因,此外,熱激蛋白基因BGIBMGA014536,BGIBMGA014618,BGIBMGA004614在低溫(15℃)下的顯著上調表達可能是影響產下非滯育卵的原因。因此我們進一步利用RNAi技術,在個體水平上驗證這些基因的功能。我們對剛產下的二化性家蠶Dazao非滯育卵進行滯育相關基因的dsRNA注射,并以紅色熒光蛋白基因Red和未作任何處理的蠶卵作為對照。將注射14536-dsRNA、14618-dsRNA、4614-dsRNA的蠶卵置于15℃黑暗條件下孵育,注射3345-dsRNA、486-dsRNA、9272-dsRNA、9273-dsRNA的蠶卵置于25℃光照條件下孵育,注射dsRed和未經任何處理的蠶卵作為對照組均分在兩種條件下孵育,等待化蛾產卵后,統(tǒng)計子代滯育情況。當前本部分實驗正在進行中,結果有待統(tǒng)計。
【學位單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q963
【部分圖文】：

促使蠶卵胚胎解除滯育而進入胚胎發(fā)育階段[60]。育與生物節(jié)律的研究的滯育是一種世代節(jié)律現象，光照和溫度是影響家蠶滯育的重要因素是生物鐘基因表達的重要授時因子，因此家蠶滯育與生物節(jié)律調控具有。昆蟲生物鐘在果蠅（Drosophila melanogaster）中的研究較為透徹，律是通過一個核心反饋環(huán)路來調節(jié)：節(jié)律基因 PER 和 TIM 結合成二聚細胞核，其結合到轉錄因子 CLK 和 CYC 的增強子上來反饋調節(jié)自身時光照可通過 CRY 降解 PER-TIM 二聚體，消除對轉錄因子 CLK 和 CY用，形成一個完整的反饋環(huán)路[61-64]。昆蟲滯育的研究顯示，節(jié)律基因與昆蟲滯育有著緊密的聯系。例如，Culex pipiens）干涉 period，timeless 和 CRY2，可以阻止尖音庫蚊進入而干涉 PDF（pigment dispersing factor）會得到相反的效果（圖 1.1）[65]；（Riptortus pedestris）中干涉生物鐘基因 period 和 CRY2，能夠使本該成蟲正常發(fā)育[66]。

圖 3.1 差異基因火山圖Figure 3.1 Volcanic map of differentially expressed genes3.3.4 反轉期和點青期共同差異基因分析滯育誘導是一段持續(xù)的時期，短暫的溫度變化不能影響子代滯育狀況，因此，反轉期與點青期的聚類分析有助于篩選起持續(xù)作用的滯育相關基因，通過對這兩個時期執(zhí)行聚類分析，結果獲得共同差異表達基因 44 個，包括 32 個共同上調表達基因和 12 個共同下調表達基因（表 3.5），差異基因的注釋主要涉及膜結構成分，催化活性，結合蛋白以及代謝進程等。表 3.4 反轉期和點青期共同差異基因Table 3.4 Gene analysis of common differences between blastokinesis phase and head pigmentation phaseExpression difference Gene_id Gene_descriptionUP- regulated BGIBMGA009047 Kazal domainBGIBMGA002624 Domain of unknown function DUF4773BGIBMGA014323Enolase C-terminal domain-like||Mandelate racemase/muconatelactonizing enzyme, N-terminal domainBGIBMGA007856 Alpha/beta hydrolase fold-3||Alpha/Beta hydrolase fold

第 3 章 不同溫度下二化性家蠶胚胎反轉期和點青期轉錄組測序分析3.3.5 差異表達基因的 GO 分析Gene Ontology（簡稱 GO）是基因功能國際標準分類體系。根據實驗目的篩選特異差異基因后，研究差異基因在 Gene Ontology 中的分布狀況，有助于闡明實驗中樣本差異在基因功能上的體現。GO 富集分析方法為 GOseq[109],此方法基于Wallenius 非中心超幾何分布（Wallenius non-central hyper-geometric distribution）。相對于普通的超幾何分布(Hyper-geometric distribution)，該分布的特點是從某個類別中抽取個體的概率，它不同與從某個類別之外抽取一個個體的概率，這種概率的不同是通過對基因長度的偏好性進行估計得到的，這種方法能更為準確地計算出 GO term 被差異基因富集的概率。GO term 包括三種基本分類：生物學過程（CC），細胞成分（BP）和分子功能(MF) 。GO 富集結果如圖 3.2 和圖 3.3
【參考文獻】

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本文編號：2871522