發(fā)布時(shí)間：2020-11-06 00:25

　　 水體富營(yíng)養(yǎng)化和藍(lán)藻水華的發(fā)生是全球面臨的重大環(huán)境問(wèn)題之一。全球范圍內(nèi)藍(lán)藻水華的爆發(fā)頻率和強(qiáng)度日益增加,造成水體生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的破壞和紊亂,降低水資源可利用性,影響旅游,養(yǎng)殖等行業(yè)的健康發(fā)展,也嚴(yán)重威脅人類的健康和生活。細(xì)菌在水生生態(tài)系統(tǒng)中具有十分重要的作用,是水環(huán)境中生物種群結(jié)構(gòu)和功能的組成部分,與藻類生物量的平衡密切相關(guān)。因此,溶藻細(xì)菌成為微生物控藻研究的熱點(diǎn)。滇池是中國(guó)最大的高原湖泊,具有非常重要的生態(tài)意義和經(jīng)濟(jì)意義,但近年來(lái)頻繁遭受藍(lán)藻水華的危害。因此,本研究以滇池水華藻為研究對(duì)象,研究溶藻菌及其分泌的溶藻物質(zhì)的溶藻特性與溶藻作用機(jī)制,從而為滇池藍(lán)藻水華的防治提供優(yōu)質(zhì)的控藻細(xì)菌或物質(zhì)資源和理論指導(dǎo)。主要結(jié)果如下:1.溶藻細(xì)菌的分離和鑒定。從滇池分離得到了1株高效溶藻細(xì)菌Sp34,根據(jù)其16S rRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析,Sp34屬于Bacillus licheniformis。2.Bacillus licheniformis Sp34對(duì)同樣分離自滇池的銅綠微囊藻DCM4溶藻特性研究。菌株Bacillus licheniformis Sp34對(duì)初始葉綠素a濃度為2 mg/L的銅綠微囊藻的六天去除率為76%,Sp34的最低初始抑藻濃度為1.35×10~5 CFU/mL,另外對(duì)銅綠微囊藻NIES843的溶藻作用也能達(dá)到97%,表明其能高效的殺滅銅綠微囊藻。而銅綠微囊藻是一種最常見(jiàn)水華藍(lán)藻優(yōu)勢(shì)種,其能產(chǎn)生微囊藻毒素,威脅環(huán)境安全和人類健康。同時(shí),Sp34也能抑制其它有害水華藻類的生長(zhǎng),包括惠氏微囊藻和席藻。因而利用Sp34作為潛在控藻資源具有重要應(yīng)用價(jià)值。Sp34通過(guò)釋放胞外溶藻物質(zhì)的間接方式溶藻,并且,溶藻物質(zhì)可能為具有溫度和酸堿耐受性的非蛋白類物質(zhì)。通過(guò)對(duì)其溶藻物質(zhì)性質(zhì)的研究,為后續(xù)分離純化溶藻物質(zhì)提供支持和指導(dǎo)。3.菌株Sp34分泌的胞外溶藻物質(zhì)的溶藻條件探究。24 h光照和14:10 h光暗循環(huán)的條件下,菌株Sp34無(wú)菌上清液的溶藻效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于黑暗條件下,其溶藻作用具有一定的光依賴性。此外,28°C下,其無(wú)菌上清液的殺藻率顯著高于15°C時(shí)。同時(shí),28℃時(shí),藻的生長(zhǎng)受到促進(jìn),而15℃時(shí),藻的生長(zhǎng)受到抑制。結(jié)合溫度和光照實(shí)驗(yàn),Sp34無(wú)菌上清液的殺藻率與銅綠微囊藻的生長(zhǎng)顯著正相關(guān),其產(chǎn)生的胞外溶藻物質(zhì)的殺藻作用依賴于銅綠微囊藻的良好生長(zhǎng),因此,菌株Sp34或者其溶藻物質(zhì)在嚴(yán)重藍(lán)藻水華的控制方面很有應(yīng)用前景。4.菌株Sp34分泌的胞外溶藻物質(zhì)的溶藻機(jī)制研究。Sp34無(wú)菌上清液處理后,銅綠微囊藻細(xì)胞完整性受到嚴(yán)重破壞,細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶(CAT)活性以及丙二醛(MDA)含量顯著增加,還原型谷胱甘肽(GSH)含量顯著減少。Sp34無(wú)菌上清液可能導(dǎo)致藻細(xì)胞的氧化脅迫,并進(jìn)一步引起藻細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化。此外,本研究證實(shí)了菌株Sp34分泌的胞外溶藻物質(zhì)嚴(yán)重抑制了銅綠微囊藻DCM4的光合作用相關(guān)基因psaB、psbD1和rbcL的轉(zhuǎn)錄表達(dá),DNA修復(fù)相關(guān)基因recA和微囊藻毒素合成相關(guān)基因mcyB的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。因此,對(duì)菌株Sp34分泌的胞外溶藻物質(zhì)溶解銅綠微囊藻的作用機(jī)制的初步猜測(cè)為:在芽孢桿菌Sp34分泌的溶藻物質(zhì)作用下,對(duì)藻細(xì)胞造成氧化脅迫,觸發(fā)藻細(xì)胞內(nèi)抗氧化機(jī)制,使得藻細(xì)胞內(nèi)CAT含量升高而GSH含量降低;氧化脅迫的進(jìn)一步作用下,藻細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),導(dǎo)致膜脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量增加,進(jìn)而導(dǎo)致藻細(xì)胞完整性的破壞。同時(shí)其分泌的胞外溶藻物質(zhì)也對(duì)藻細(xì)胞的DNA造成損傷,影響藻細(xì)胞光合作用的正常運(yùn)行,抑制藻細(xì)胞內(nèi)微囊藻毒素的合成,最終殺滅藻細(xì)胞。5.溶藻物質(zhì)色胺的鑒定及其溶藻特性研究。Bacillus licheniformis Sp34能在含有色氨酸的培養(yǎng)基中產(chǎn)生色胺。同時(shí),Sp34的1/8 LB培養(yǎng)液中也含有色胺,色胺對(duì)銅綠微囊藻DCM4具有良好的溶藻作用,Sp34主要通過(guò)分泌胞外溶藻物質(zhì)溶藻,因此推測(cè)色胺是Sp34分泌的溶藻物質(zhì)之一。色胺的溶藻作用具有一定的光依賴性和溫度依賴性,結(jié)合其溫度和光照實(shí)驗(yàn),其溶藻作用依賴于銅綠微囊藻的良好生長(zhǎng)。6.色胺溶藻機(jī)制的初步研究。色胺的作用下,藻細(xì)胞內(nèi)ROS含量快速增加,藻細(xì)胞內(nèi)氧化水平顯著升高,可能導(dǎo)致藻細(xì)胞的氧化損傷。細(xì)胞內(nèi)部總蛋白和碳水化合物含量顯著下降,單個(gè)藻細(xì)胞內(nèi)蛋白和糖含量增加,表明色胺可能導(dǎo)致藻細(xì)胞分裂受到抑制,嚴(yán)重影響藻細(xì)胞的生長(zhǎng),最終造成藻細(xì)胞死亡。綜上,本研究分析了一株來(lái)自滇池的高效溶藻菌及其分泌的溶藻物質(zhì)對(duì)同樣分離自滇池的銅綠微囊藻的溶藻特性及溶藻機(jī)制。本研究成果將為藍(lán)藻水華的微生物治理提供控藻資源與相關(guān)理論指導(dǎo)。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：X52;X172
【部分圖文】：

研究技術(shù)路線

下生長(zhǎng)良好。為了進(jìn)一步對(duì) Sp34 進(jìn)行鑒定，其 16S rRNA 基因序列測(cè)得后，在EZBioCloud 和 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行 BLAST 比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與多株芽孢桿菌(Bacillus sp.)的相似度超過(guò)99%。根據(jù)菌株Sp34的16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2-1），結(jié)果其與地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)親緣關(guān)系最近。圖 2-1 菌株 Sp34 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 2-1 Phylogenetic tree of Sp34 based on 16S rRNA gene sequences2.2.1.2 溶藻菌的生長(zhǎng)曲線為了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的方便與統(tǒng)一，測(cè)定了溶藻菌 Sp34 的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果如圖 2-2所示，根據(jù)生長(zhǎng)曲線，可以判斷出Sp34在本實(shí)驗(yàn)的條件下的不同生長(zhǎng)時(shí)期分別為：調(diào)整期（0-2 h），對(duì)數(shù)期（2-6 h），穩(wěn)定期（6-8 h）。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇穩(wěn)定期的菌進(jìn)行（OD600值為 0.7）。

圖 2-2 Sp34 的生長(zhǎng)曲線。Figure 2-2 Growth curve of Sp34.速判斷菌液的細(xì)胞數(shù)量，將 Sp34 菌液的 OD600值與細(xì)胞數(shù)量建-3 所示，OD600和細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量具有良好的線性關(guān)系。后續(xù)實(shí)驗(yàn)數(shù)量時(shí)，可以通過(guò) OD600值來(lái)獲得。
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本文編號(hào)：2872408