發(fā)布時(shí)間：2020-11-06 18:02

　　 AHI1基因廣泛地存在于自然界中的多種生物中,從魚類、小鼠到靈長類生物以及人類均存在AHI1基因。人類的AHI1蛋白包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域,N端的Coiledcoil結(jié)構(gòu)域,中端的WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域,以及C端的SH 3結(jié)構(gòu)域,其中WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域與SH3結(jié)構(gòu)域較為保守,在多種動物的AHI1蛋白中共同存在。AHI1與腦神經(jīng)組織的發(fā)育有著密切的聯(lián)系,AHI1基因突變可引起早期腦部發(fā)育障礙的朱伯特綜合癥(Joubert Syndrome)發(fā)病,然而具體病理機(jī)理仍不清楚。相較于小鼠,斑馬魚的Ahi1蛋白結(jié)構(gòu)與人類更加相似,故我們利用斑馬魚作為動物模型研究ahi1在早期腦部發(fā)育中的作用。通過原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)ahi1在斑馬魚胚胎發(fā)育早期已經(jīng)存在表達(dá),并且大量特異地表達(dá)在斑馬魚幼魚頭部的各個(gè)組織中。而后隨著發(fā)育時(shí)間的推移,ahi1在斑馬魚頭部的表達(dá)量逐漸減少。我們向單細(xì)胞時(shí)期的斑馬魚胚胎中注射反義嗎啉代寡核苷酸(morpholino)敲減ahi1的表達(dá),通過反轉(zhuǎn)錄PCR發(fā)現(xiàn)在morpholino注射后的胚胎中產(chǎn)生了缺失兩個(gè)外顯子的ahi1 mRNA。并且觀察到注射后的胚胎在發(fā)育到第四天時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)了視神經(jīng)投射異常的現(xiàn)象,其中包括視神經(jīng)穿越中線異常和視神經(jīng)生長延伸異常,同時(shí)眼組織面積也出現(xiàn)了顯著的減小。通過p53 morpholino和control morpholino分別與ahi1 morpholino的共注射,我們確認(rèn)了這種通過ahi1敲減導(dǎo)致的斑馬魚幼魚出現(xiàn)的視神經(jīng)投射異常及眼組織面積減小的表型是特異的,而非由于morpholino的毒性或是注射損傷造成。由于我們發(fā)現(xiàn)在Ahi1 null的斑馬魚幼魚中并未出現(xiàn)類似上述的視神經(jīng)投射異常和或眼組織面積減小的表型,于是決定利用CRISPR-Cas9技術(shù)在ahi1morpholino作用位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)了兩個(gè)敲除位點(diǎn),并創(chuàng)造了一批模擬morpholino作用的臨近位點(diǎn)突變或缺失的Ahi1 truncated的斑馬魚。檢測這些Ahi1 truncated斑馬魚幼魚后發(fā)現(xiàn),它們中出現(xiàn)了高比例與morpholino注射后相似的視神經(jīng)投射異常及眼組織面積減小的表型。由此推斷truncated Ahi1蛋白由于在WD40結(jié)構(gòu)域部分氨基酸缺失,導(dǎo)致產(chǎn)生了獲得功能性毒性,并因此造成斑馬魚在早期發(fā)育時(shí)出現(xiàn)視神經(jīng)投射異常和眼部組織面積減小的現(xiàn)象。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q436
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 引言
    1.1 AHI1基因與AHI1蛋白
        1.1.1 AHI1基因
        1.1.2 AHI1蛋白
        1.1.3 AHI1蛋白與纖毛結(jié)構(gòu)
    1.2 AHI1基因與信號通路
        1.2.1 AHI與WNT/β-catenin信號通路
        1.2.2 AHI與BDNF/TrkB信號通路
        1.2.3 AHI與攝食行為
    1.3 AHI1基因與疾病
        1.3.1 AHI1與朱伯特綜合癥
        1.3.2 AHI1與自閉癥
        1.3.3 AHI1與精神分裂癥
        1.3.4 AHI1與情感性精神障礙
        1.3.5 AHI1與多發(fā)性硬化
第2章 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)動物
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)器材
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)藥品
        2.1.4 分子實(shí)驗(yàn)試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)器材、藥品與試劑
        2.2.1 胚胎Morpholino注射及培養(yǎng)
        2.2.2 斑馬魚總RNA的提取
        2.2.3 斑馬魚總cDNA的制備
        2.2.4 TA克隆與轉(zhuǎn)化
        2.2.5 擴(kuò)大培養(yǎng)與陽性克隆的選擇
        2.2.6 CRISPR-Cas9與gRNA的注射
        2.2.7 斑馬魚基因敲除檢測實(shí)驗(yàn)
        2.2.8 RNA探針的制備
        2.2.9 原位雜交實(shí)驗(yàn)
        2.2.10 胚胎免疫熒光染色
        2.2.11 幼魚的視神經(jīng)注射及投射觀察
第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
    3.1 AHI1蛋白在不同物種間的結(jié)構(gòu)差異
    3.2 ahi1基因在斑馬魚中的時(shí)空表達(dá)
    3.3 ahi1Morpholino的敲減效力驗(yàn)證
    3.4 ahi1敲減引起斑馬魚視神經(jīng)投射異常
        3.4.1 ahi1 morpholino注射后引起兩種視神經(jīng)投射異常
        3.4.2 ahi1 morpholino與WT視神經(jīng)異常幼魚數(shù)量對比
        3.4.3 ahi1 morpholino引起幼魚平均視神經(jīng)投射長度縮短
        3.4.4 ahi1 morpholino引起幼魚平均眼組織面積減小
        3.4.5 單眼數(shù)據(jù)二維點(diǎn)狀分布圖
    3.5 ahi1敲減致視神經(jīng)投射異常表型具有特異性
        3.5.1 ahi morpholino引起的異常表型是特異的
        3.5.2 ctrl或p53 morpholino注射不引起視神經(jīng)投射異常
        3.5.3 ctrl morpholino與視神經(jīng)長度及眼組織面積
        3.5.4 p53 morpholino與視神經(jīng)長度及眼組織面積
        3.5.5 ctrl與p53 morpholino的比較
    3.6 Ahi1 null斑馬魚視神經(jīng)投射正常
    3.7 ahi1敲除斑馬魚品系的建立
    3.8 ahi1敲除品系斑馬魚視神經(jīng)投射異常
第4章 結(jié)論與展望
    4.1 結(jié)論
        4.1.1 ahi1基因與斑馬魚早期視神經(jīng)投射過程相關(guān)
        4.1.2 ahi1morpholino特異性導(dǎo)致視神經(jīng)投射異常
        4.1.3 截短的ahi1蛋白會導(dǎo)致斑馬魚視神經(jīng)投射異常
    4.2 討論
    4.3 進(jìn)一步工作方向
第5章 總結(jié)
致謝
參考文獻(xiàn)

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