發(fā)布時(shí)間：2020-11-06 19:45

　　 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells,Treg細(xì)胞)是一類(lèi)CD4~+T細(xì)胞亞群,能夠控制體內(nèi)自身免疫系統(tǒng)對(duì)機(jī)體造成的損傷。在Treg細(xì)胞分化和發(fā)育過(guò)程中以及維持功能穩(wěn)定的過(guò)程中FOXP3(forkhead-box亞家族成員)發(fā)揮著重要功能。硬骨魚(yú)類(lèi)是同時(shí)具有獲得性免疫和固有免疫的低等脊椎動(dòng)物,具有和哺乳動(dòng)物相類(lèi)似的T、B淋巴細(xì)胞,對(duì)它們的研究對(duì)于理解免疫分子演化過(guò)程具有重要價(jià)值。目前大部分研究認(rèn)為硬骨魚(yú)類(lèi)能夠產(chǎn)生和哺乳類(lèi)功能相似的Treg細(xì)胞,且已經(jīng)相繼從黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)、尼羅羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、大西洋鮭(Salmo salar)克隆得到了foxp3的同源分子的全長(zhǎng)cDNA,并從斑馬魚(yú)(Danio rerio)中克隆了foxp3的同源分子的ORF序列(5’-UTR和3’-UTR為預(yù)測(cè)序列)。這些研究主要局限于mRNA水平和蛋白水平時(shí)空分布表達(dá)的研究,對(duì)FOXP3參與硬骨魚(yú)類(lèi)獲得性免疫過(guò)程及其免疫應(yīng)答變化情況研究較少。斑馬魚(yú)額外的染色體加倍事件導(dǎo)致存在兩個(gè)拷貝的foxp3同源基因,即foxp3a和foxp3b,使得魚(yú)類(lèi)的Treg細(xì)胞及FOXP3研究變得更加復(fù)雜。為了豐富硬骨魚(yú)類(lèi)FOXP3研究,本研究首先構(gòu)建了斑馬魚(yú)(Danio rerio)cDNA文庫(kù),采用RACE技術(shù)克隆得到斑馬魚(yú)foxp3a和foxp3b基因cDNA(含5’-UTR和3’-UTR),并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,在此基礎(chǔ)上選擇了斑馬魚(yú)foxp3a和foxp3b特異性片段分別構(gòu)建了攜帶有HIS融合標(biāo)簽重組原核表達(dá)質(zhì)粒,表達(dá)和純化了重組融合蛋白,并制備了抗FOXP3A和FOXP3B的兔源多克隆抗血清,采用間接ELISA以及Western blot方法對(duì)多克隆抗血清進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)半定量PCR和整胚原位雜交技術(shù)(WISH)對(duì)斑馬魚(yú)foxp3a和foxp3b時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行研究;另一方面,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法,對(duì)腹腔注射嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)后斑馬魚(yú)腎臟中免疫因子的應(yīng)答模式進(jìn)行研究。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1)斑馬魚(yú)foxp3a和foxp3b的克隆結(jié)果表明,本研究成功克隆得到斑馬魚(yú)foxp3a和foxp3b基因cDNA。foxp3a基因的全長(zhǎng)cDNA是1819 bp,其中開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1260 bp,并編碼一個(gè)由419個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì);foxp3b基因的cDNA是1316 bp,其中開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)為1185 bp,編碼394個(gè)氨基酸。蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果顯示斑馬魚(yú)FOXP3A和FOXP3B含有FOXP家族的特征性結(jié)構(gòu),即鋅指結(jié)構(gòu)和FKH結(jié)構(gòu)域。多重序列比對(duì)結(jié)果顯示,斑馬魚(yú)FOXP3A和FOXP3B氨基酸在鋅指結(jié)構(gòu)域、亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域和FKH結(jié)構(gòu)域高度保守。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,斑馬魚(yú)FOXP3A和FOXP3B首先與魚(yú)類(lèi)聚為一類(lèi),其次與哺乳類(lèi)聚為一支,提示斑馬魚(yú)FOXP3A和FOXP3B為哺乳動(dòng)物FOXP3的直系同源分子。2)斑馬魚(yú)foxp3a和foxp3b時(shí)間表達(dá)模式的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,斑馬魚(yú)foxp3a和foxp3b的表達(dá)水平隨著受精卵的發(fā)育呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性變化,foxp3a和foxp3b都是從12hpf開(kāi)始表達(dá),隨著受精卵的發(fā)育,foxp3a的表達(dá)水平逐漸升高;24 hpf(hours post fertilization)時(shí)foxp3b表達(dá)量最高,之后隨著斑馬魚(yú)胚胎的發(fā)育,foxp3b的表達(dá)水平又出現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì);組織表達(dá)模式的結(jié)果顯示斑馬魚(yú)foxp3a和foxp3b基因分布廣泛,在淋巴組織和非淋巴組織中均有表達(dá);其次采用整胚原位雜交技術(shù)檢測(cè)斑馬魚(yú)foxp3a和foxp3b在胚胎發(fā)育中的表達(dá)模式。分別選擇foxp3a基因3’末端1415 bp和foxp3b基因3’末端615 bp的特異區(qū)段,反向克隆到pGEM-T-easy載體,成功構(gòu)建了pGEM-T-easy-foxp3a和pGEM-T-easy-foxp3b原位雜交探針表達(dá)載體。體外合成地高辛標(biāo)記的反義RNA探針。原位雜交結(jié)果顯示,在胚胎發(fā)育至12 h時(shí),foxp3a和foxp3b分布廣泛,整個(gè)胚胎均有表達(dá),隨著胚胎發(fā)育逐漸集中到中胚層和頭部。3)嗜水氣單胞菌感染斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在細(xì)菌感染過(guò)程中,斑馬魚(yú)腎臟中il-1β的mRNA表達(dá)量相對(duì)于PBS組均有顯著升高(24 hpi,P=0.026;7 dpi,P=0.002);感染組7 d比24 h的表達(dá)量相比顯著降低(P=0.026)。foxp3a在細(xì)菌感染后24 h比對(duì)照組表達(dá)量顯著升高(P=0.017),感染組7 d比24 h的表達(dá)量相比顯著降低(P=0.026);foxp3b基因mRNA在細(xì)菌感染后24 h(P=0.675)和7 d(P=0.238)表達(dá)量相對(duì)于PBS組來(lái)說(shuō)無(wú)顯著性差異。4)本實(shí)驗(yàn)通過(guò)原核表達(dá)FOXP3A和FOXP3B部分片段的重組蛋白,經(jīng)純化后制備了多克隆抗血清。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在16℃,IPTG濃度為0.5 mmol/L,誘導(dǎo)10小時(shí)的條件下,SDS-PAGE結(jié)果表明,51.7 kDa的S-FOXP3A-HIS融合蛋白以包涵體形式大量表達(dá),49.5 kDa的S-FOXP3B-HIS蛋白在上清中大量表達(dá)。ELISA檢測(cè)顯示,多克隆抗血清的效價(jià)均在1.6×10~5以上。進(jìn)一步通過(guò)Western blot方法鑒定抗血清能否識(shí)別融合蛋白,研究表明,獲得的多克隆抗血清能識(shí)別FOXP3A和FOXP3B融合蛋白。本研究一方面成功克隆了斑馬魚(yú)foxp3a和foxp3b的cDNA(含5’-UTR和3’-UTR),并通過(guò)多種方法檢測(cè)了多個(gè)組織中的mRNA水平表達(dá)模式,證實(shí)斑馬魚(yú)foxp3a和foxp3b不僅表達(dá)于淋巴樣組織中而且還表達(dá)于非淋巴組織中。硬骨魚(yú)類(lèi)與哺乳類(lèi)foxp3保守的mRNA水平表達(dá)模式提示其可能具有保守的生物學(xué)功能;另一方面,研究了嗜水氣單胞菌感染的過(guò)程中,斑馬魚(yú)foxp3a和foxp3b基因在免疫應(yīng)答過(guò)程中的表達(dá)情況,初步表明foxp3a可能是斑馬魚(yú)中有功能的同源分子,同時(shí)也提示在低等脊椎動(dòng)物中foxp3可能在免疫中同樣發(fā)揮了重要作用。另外,本研究制備的多克隆抗血清為今后更深入的研究斑馬魚(yú)FOXP3A和FOXP3B打下了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：Q78;S917.4
【部分圖文】：

斑馬魚(yú) foxp3a 和 foxp3b 的 cDNA 克隆及其在細(xì)菌免疫應(yīng)答中的表達(dá)研究.4 FOXP 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，斑馬魚(yú)FOXP3A與草魚(yú)FOXP3聚為一分類(lèi)亞支，而FOXP3黑青斑河豚、大西洋鮭和河豚 FOXP3 聚為一支，然后進(jìn)一步與其他物種的 FOXP為一支，與 FOXP 家族的其他幾個(gè)成員（FOXPl/2/4）聚為不同的分類(lèi)支，提示斑魚(yú) FOXP3A 和 FOXP3B 為哺乳動(dòng)物 FOXP3 的同源分子，而斑馬魚(yú) FOXP3 可能源部分魚(yú)類(lèi)特有的基因組復(fù)制（圖 2.4）。

圖 2.5 foxp3 在人和斑馬魚(yú)染色體上的基因位置圖。人和斑馬魚(yú) foxp3 基因相對(duì)位置是在 EnsemGenome Browser 網(wǎng)站（http://www.ensembl.org）上分析得到的。條形框間長(zhǎng)度不代表基因間距離Fig2.5 Gene locus maps for foxp3 on human and zebrafish chromosome．Gene maps were constructed using the Ensembl Genome Browser (http://www.ensembl.org). The blengths were not proportional to the distances between genes.3 討論FOXP3 是叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員，與調(diào)節(jié)性 T 淋巴細(xì)胞的生成和功能[83]。2001 年 Brunkow 等首次報(bào)道了 foxp3，至此后對(duì)于 foxp3 的研究受到越

又出現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。圖 3.1 斑馬魚(yú)不同時(shí)間點(diǎn)胚胎中 foxp3a（A）和 foxp3b（B）表達(dá)初步DNA 模板；2：沒(méi)加反轉(zhuǎn)錄酶的陰性對(duì)照；3：模板為 ddH2O 陰性對(duì)照組模板；5：沒(méi)加反轉(zhuǎn)錄酶的陰性對(duì)照；6：模板為 ddH2O 陰性對(duì)照組 The expression of foxp3a (A)and foxp3b(B) mRNAs in different time after Danio rerio cDNA; 2: Negative control without reverse transcriptase; 3: Negative contro cDNA; 5: Negative control without reverse transcriptase; 6: Negative contro6h 12h 24h 36h 48h 60h 72h 7d -aCy3M 4 5 6B(bp)50040030020015010050(bp)M 1 2 350040030020015010050A
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