發(fā)布時間：2020-11-10 10:44

　　 臍帶間充質(zhì)干細胞(Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,UCMSCs)是一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞。UCMSCs具有來源豐富、不涉及倫理道德、低免疫原性、體外擴增能力強及能分化為多種體細胞等特征,因此,UCMSCs的相關(guān)研究備受關(guān)注。目前,已成功從人、大鼠、兔、豬等動物分離獲得臍帶間充質(zhì)干細胞,但與其相比,關(guān)于綿羊臍帶間充質(zhì)干細胞(sheep Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,sUCMSCs)的分離、培養(yǎng)及定向分化等研究的相關(guān)報道甚少。綿羊是基礎(chǔ)生物學及畜牧學等研究領(lǐng)域的重要大動物模型。據(jù)此,本研究在改良sUCMSCs分離及培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上,探討了誘導sUCMSCs為誘導多能性干細胞(Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs)的同時將sUCMSCs定向誘導分化為成肌細胞并初步探究其在體內(nèi)修復損傷組織的作用機制。本研究主要研究結(jié)果如下:1.建立了組織塊二次貼壁分離綿羊臍帶間充質(zhì)干細胞的方法,并用改良的無血清體系在體外擴增培養(yǎng)獲得了綿羊臍帶間充質(zhì)干細胞,經(jīng)鑒定,所獲得的sUCMSCs的免疫表型在高表達CD90、CD105及CD44(表達量在95%以上)的同時,低表達CD45、CD34及CD14(表達量在2%以下)。此外,組織塊二次貼壁法獲得的sUCMSCs可在體外傳至12代,并且能向成骨、成脂及成軟骨細胞方向分化。2.采用Yamanaka的OSKM四因子方法誘導sUCMSCs為iPSCs,獲得了類胚胎干細胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)的克隆樣細胞,對其進行堿性磷酸酶染色鑒定,結(jié)果顯示克隆呈棕紅色的陽性結(jié)果;此外,對所獲得的克隆進行多能性因子表達情況的檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),克隆表達多能性因子OCT-4、SSEA-4、Nanog及TRA-1-81;為檢測獲得的sUCMSCs來源的克隆在體內(nèi)分化能力,將克隆制備成單細胞懸液后注射免疫缺陷小鼠腋下,在注射后第4周采集畸胎瘤制成石蠟切片后進行HE染色,在倒置顯微鏡下可觀察到肌肉、毛囊、腺體等三個胚層的組織。3.采用5-氮雜胞苷聯(lián)合馬血清法,誘導sUCMSCs分化為成肌細胞,檢測分化不同時期成肌細胞標志蛋白Desmin、MyHC及MyoD與標志分子Desmin、Myf5及MyoG的表達情況;此外,將sUCMSCs、分化第14天的成肌細胞及絲裂霉素C處理的sUCMSCs移植入肌肉損傷模型小鼠的脛骨前肌,在移植細胞后不同時間經(jīng)石蠟切片并HE染色,檢測小鼠損傷的肌肉的修復情況。結(jié)果顯示:(1)在5-氮雜胞苷及馬血清的聯(lián)合作用下,sUCMSCs在誘導分化第3天Myf5基因開始表達;第7天個別細胞形態(tài)發(fā)生改變,呈桿狀、多角狀,細胞增殖減緩,且成肌細胞標志蛋白Desmin、MyHC及MyoD均有表達,有部分細胞發(fā)生融合;在分化第14天Desmin及MyoG基因表達量升高,細胞增殖持續(xù)減緩,融合細胞增多,且融合后的細胞內(nèi)細胞核增多;在分化的第21天Desmin基因表達量驟升,且細胞代謝產(chǎn)物增多,出現(xiàn)肌管樣結(jié)構(gòu);(2)在細胞移植后,sUCMSCs組小鼠損傷肌肉后第2天即進入修復期,在第10天肌纖維排列致密,彼此融合,損傷肌肉基本恢復正常;成肌細胞組小鼠損傷肌肉第3天即進入修復期,在第14天肌纖維排列致密,彼此融合,損傷肌肉基本恢復正常;絲裂霉素C組及對照組小鼠損傷肌肉在第2-3天進入修復期,且在第10天損傷肌肉未能完全修復,肌纖維之間仍存在明顯的空隙,第14天肌肉也未能完全恢復正常。綜上所述,采用二次貼壁法及無血清培養(yǎng)體系可獲得形態(tài)及體外增殖能力正常、且表達間充質(zhì)干細胞表面標志分子并具有多向分化潛能的sUCMSCs。所獲得的sUCMSCs不僅能誘導為iPSCs,而且可分化為對小鼠損傷肌肉有修復功能的成肌細胞。本研究為建立完善的綿羊誘導多能干細胞技術(shù)及探明間充質(zhì)干細胞的定向分化及修復機制提供科學依據(jù)。
【學位單位】：東北林業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q2-33
【部分圖文】：

?傳統(tǒng)組織塊貼壁法，使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基（含ＦＢＳ）培養(yǎng)４８ｈ即貼壁４天可見呈長梭形的??細胞爬出（圖２．１ａ），９天左右細胞融合度可達９０％?（圖２．１ｂ）；使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的組??織塊同樣４８ｈ貼壁４天可見呈長梭形的細胞爬出（圖２．１ｃ），１０天左右細胞融合度可達９０％??（圖?２．１ｄ）。??二次貼壁法，使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基（含ＦＢＳ）培養(yǎng)２４ｈ即可見組織塊貼壁，２天細胞即爬出??（圖２．１ｅ），６天左右細胞融合度可達９０％?（圖２．１ｆ）；使用無血清培養(yǎng)基２４ｈ可見組織塊貼??壁，２天可見細胞爬出（圖２．?ｌｇ），?６天左右細胞融合度可達９０％?（圖２．?ｌｈ）。??４組細胞在貼壁伸展后均呈長梭形，待細胞融合度達８５％時，排列緊密，呈渦旋狀或指??紋狀，上述結(jié)果表明與傳統(tǒng)組織塊貼壁法相比，二次貼壁法的組織塊貼壁更快，細胞爬出時??間更短，且能將有限的材料在短時間內(nèi)充分利用并獲取數(shù)量加倍的細胞。此外，通過比較含??血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基與無血清培養(yǎng)基分離原代細胞的結(jié)果發(fā)現(xiàn)

養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞使用Ｔｉｙｐｓｉｎ，而無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞使用ＴｒｙｐＬＥ）將４組綿羊臍帶間??充質(zhì)干細胞進行消化傳代擴增。??４組綿羊臍帶間充質(zhì)干細胞的Ｐ３代細胞增殖速度一致，３ｄ融合度均可達８５％?（圖２．２??ａ，ｃ，ｅ，ｇ），且細胞排列緊密，呈指紋狀，細胞形態(tài)均一，細胞呈成纖維細胞樣貼壁生??長，細胞飽滿，細胞核大，胞衆(zhòng)透明無雜質(zhì)，而Ｐ１２代細胞在３＞４ｄ內(nèi)融合度也可達８５％，??細胞形態(tài)正常，與Ｐ３代細胞相似，呈長梭形旋禍狀貼壁生長（圖２．２?ｂ，ｄ，ｆ，ｈ）。上述結(jié)??果表明，二次貼壁法獲得的細胞與傳統(tǒng)的貼壁法獲得的細胞在傳代培養(yǎng)后細胞生長速度一??致，細胞形態(tài)及狀態(tài)無明顯差異，無血清培養(yǎng)基并未因缺乏ＦＢＳ而對細胞造成不良影響，??傳代后的細胞形態(tài)及生長狀態(tài)與含ＦＢＳ培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞無明顯差異

?臺期，分別比較４組細胞Ｐ３及Ｐ１２代細胞的增殖能力發(fā)現(xiàn)，（１）傳統(tǒng)貼壁法，間充質(zhì)干細??胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基與無血清培養(yǎng)基獲得的Ｐ３代細胞的増殖能力均強于Ｐ１２代細胞（圖２．３?ｂ，??ｄ）；?（２）二次貼壁法，間充質(zhì)干細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基與無血清培養(yǎng)基獲得的獲得Ｐ３代細胞的增??殖能力均較Ｐ１２代細胞強（圖２．３?ｃ，?ｅ）。上述結(jié)果說明，組織塊二次貼壁法獲得的綿羊臍??帶間充質(zhì)干細胞的增殖能力與傳統(tǒng)組織塊貼壁法獲得的細胞無顯著差異，此外，無血清培養(yǎng)??體系培養(yǎng)的細胞的增殖能力與含ＦＢＳ的培養(yǎng)基獲得的細胞也無明顯差異，但是Ｐ１２代細胞??的增殖能力比Ｐ３代細胞略低。??ａ?ｂｅ??２．〇ｉ??？１５＿?＾?ｊ??匕?１．０－??????
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 邵偉;秦小惠;古再麗;況玲;余雄;;綿羊臍帶間充質(zhì)干細胞的分離、體外培養(yǎng)及誘導分化[J];新疆農(nóng)業(yè)大學學報;2012年04期

2 張勇;鄒仲敏;郭朝華;周進明;王勁;羅成基;程天民;;間充質(zhì)干細胞經(jīng)MyoD轉(zhuǎn)染誘導為成肌細胞后對肌損傷的修復作用[J];解放軍醫(yī)學雜志;2008年11期

相關(guān)碩士學位論文 前1條

1 宋紅衛(wèi);利用綿羊多能性因子誘導小鼠體細胞為多能性干細胞[D];東北林業(yè)大學;2016年

本文編號：2877840