發(fā)布時(shí)間：2020-11-10 19:02

　　 枯草芽孢桿菌高溫發(fā)酵的醬香型食品(如白酒)、中低溫發(fā)酵的豉香型食品(如豆豉)都受到人們的青睞,但醬香和豉香的產(chǎn)生機(jī)制至今還不清楚。研究通過(guò)對(duì)豆豉工業(yè)生產(chǎn)菌株Bacilus subtilis BJ3-2進(jìn)行中溫(45℃)和中低溫(37℃)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序差異性和富集分析,篩選得到19個(gè)差異顯著基因,分析選取5個(gè)顯著差異基因作為風(fēng)味候選基因并進(jìn)行熒光驗(yàn)證,最終選取rocF(精氨酸酶)進(jìn)行同源重組,雙交換敲除以驗(yàn)證其在醬(豉)香上的生理功能,主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:1.對(duì)Bacilus subtilis BJ3-2中溫(45℃)、中低溫(37℃)進(jìn)行第二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。通過(guò)表達(dá)量分析、差異基因的GO、KEGG注釋和富集分析,將差異顯著的58個(gè)基因富集在27個(gè)代謝通路,其中嘧啶代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代謝最為顯著。控制篩選條件Fold-change≧2與FDR≦0.05,最終篩選出19個(gè)顯著差異基因,結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道和綜合分析,選擇rocF(精氨酸酶)、rocG(谷氨酸脫氫酶)、uxaC(葡萄糖醛酸異構(gòu)酶)、uxuA(甘露酸脫氫酶)、pckA(磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶)為醬(豉)香候選基因。2.對(duì)轉(zhuǎn)錄組篩選出來(lái)的5個(gè)醬(豉)香候選基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證。選用16S rRNA為內(nèi)參基因,分別確定了5個(gè)醬(豉)香候選的基因的溶解曲線(xiàn)和擴(kuò)增曲線(xiàn),并計(jì)算出各自的基因表達(dá)差異,結(jié)合轉(zhuǎn)錄組差異發(fā)現(xiàn),除uxaC外,rocF、rocG、uxuA、pckA的表達(dá)趨勢(shì)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果一致。3.構(gòu)建rocF的同源重組雙交換敲除載體:pUC18+HLarm+CmR+HRarm。以pUC18為初始載體,依次通過(guò)Sac I、BamH I、Pst I、Hind III限制性酶切位點(diǎn)將從BJ3-2基因組擴(kuò)增的左臂(HLarm)、右臂(HRarm)以及pHT01cas9-p43載體上的氯霉素基因(CmR)連接,并通過(guò)菌落PCR、質(zhì)粒PCR、雙酶切、測(cè)序驗(yàn)證,最終獲得pUC18+HLarm+CmR+HRarm重組交換載體。4.將雙交換質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化BJ3-2中,轉(zhuǎn)化效率達(dá)5×10~2cfu/μg,并通過(guò)革蘭氏染色、RCR驗(yàn)證、測(cè)序驗(yàn)證,最終成功篩選出BJ3-2△rocF基因敲除菌株。5.利用BJ3-2△rocF和BJ3-2發(fā)酵豆豉,感官評(píng)定和氨氣檢測(cè)顯示:BJ3-2△rocF發(fā)酵的豆豉較BJ3-2發(fā)酵的豆豉,37℃時(shí),顏色、豉香、醬香、質(zhì)地、氨味均無(wú)明顯變化,僅黏絲略有降低;45℃時(shí),顏色褐化程度降低,黏性增強(qiáng),醬香味更加突出,氨味降低112.9 ppm。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出:BJ3-2△rocF和BJ3-2 37℃發(fā)酵的豆豉感官變化不大,說(shuō)明37℃時(shí)rocF與醬豉香風(fēng)味無(wú)顯著關(guān)系;傳統(tǒng)認(rèn)為褐化與醬香呈正相關(guān),但45℃時(shí),BJ3-2△rocF發(fā)酵的豆豉褐化程度減弱,說(shuō)明褐化與醬香風(fēng)味沒(méi)有相關(guān)性,醬香味增強(qiáng)說(shuō)明rocF是醬香風(fēng)味重要的負(fù)調(diào)控基因,氨味降低,說(shuō)明rocF通過(guò)精氨酸代謝影響氨氣含量。研究通過(guò)成功敲除rocF,為研究醬(豉)香風(fēng)味基因的功能提供了方法借鑒;通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、熒光定量PCR驗(yàn)證、基因敲除等手段為探索醬香和豉香型產(chǎn)品中風(fēng)味的形成機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：TS201.3
【部分圖文】：

圖 1.1 Bacilus subtilis 中 TTMP 的產(chǎn)生途徑Figure 1.1 Pathway of TTMP production in bacillus subtilis香風(fēng)味基因的篩選方法方法有很多，主要有 mRNA 差異顯示技術(shù)（楊曉霞 等，宏 等，2017）、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（汪最 等，2018）、抑制消減、基因敲除（張慧 等，2014）、基因突變（趙銀娟 等，2 等，2016）、生物信息學(xué)、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 等，一般，但為保證篩選可信度，要根據(jù)研究對(duì)象、研究目的以及實(shí)研究。技術(shù)酸行使功能的主要承擔(dān)者，是細(xì)胞功能和狀態(tài)最直接的描述生物功能的必然紐帶，轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控是目前研究最多，也是

圖 1.2 同源重組交換示意圖Figure 1.2 Schematic diagram of homologous recombination exchange基因敲除或整合的主要步驟包括:(1)構(gòu)建重組載體。(2)電擊、化學(xué)誘導(dǎo)等方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞。(3)篩選目的細(xì)胞或菌落。(4)傳代培養(yǎng)并篩選已敲除或已整合的宿主。(5)進(jìn)行形態(tài)觀察及分子生物學(xué)檢測(cè)。1.3.2 同源重組在枯草芽孢桿菌中的運(yùn)用同源重組被發(fā)現(xiàn)后，科學(xué)家們很快就將該技術(shù)運(yùn)用到生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。同源重組技術(shù)也被運(yùn)用到了 Bacilus subtilis 上，Bacilus subtilis 由于高蛋白分泌能力和良好發(fā)酵基礎(chǔ)被廣泛地運(yùn)用在工業(yè)生產(chǎn)中，為了提高菌株的優(yōu)良特性，就需要對(duì)菌株進(jìn)行分子改造張明俐（張明俐 等，2016）等利用同源重組技術(shù)，快速構(gòu)建枯草芽孢桿菌 168（Bacilusubtilis168）spo0A 敲除載體 pMAD-Δspo0A，無(wú)痕敲除后得到了不長(zhǎng)芽孢的枯草芽孢桿菌，對(duì)提高枯草芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)效率有重要意義；張懿翔（張懿翔 等，2015）等通過(guò)同源重組將透明顫菌血紅蛋白(VHb)基因(vgb)整合到枯草芽孢中，改善枯草芽孢桿菌

貴州大學(xué)碩士畢業(yè)論文4. 通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶（Sac I 和 BamH I）將 Bacilus subtilis BJ3-2 基因組中擴(kuò)增的上游同源臂（HLarm ）通過(guò)連接 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5α 中， 提取得到質(zhì)粒pUC18+HLarm+p43+cat+HRarm。5. pUC18 為克隆載體，只添加 p43 啟動(dòng)子和氯霉素的編碼區(qū)，沒(méi)有終止子并不能使菌株帶有氯霉素抗性，因此對(duì)先前構(gòu)建的 pUC18+HLarm+p43+cat+HRarm 載體進(jìn)行完善，利用 Pst I、BamH I 酶切位點(diǎn)將質(zhì)粒上的 p43+cat 替換成從 pHT01cas9-p43 質(zhì)粒 上 帶 有 啟 動(dòng) 子 、 編 碼 區(qū) 、 終 止 子 的 CmR 基 因 。 利 用 在 線(xiàn) 網(wǎng) 址（http://molbiol-tools.ca/Promoters.htm）中的 BPROM 和 FindTerm 對(duì) pHT01cas9-p43質(zhì)粒上的 CmR 基因進(jìn)行原核啟動(dòng)子和終止子分析預(yù)測(cè)，確定無(wú)誤后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建示意圖，如圖 2.1 所示（利用軟件 SnapGene 制作）。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2878241