發(fā)布時(shí)間：2020-11-13 01:32

　　 過(guò)氧化氫酶能夠處理工業(yè)廢水中殘余的過(guò)氧化氫,所以它是在工業(yè)生產(chǎn)中一種重要的酶,但傳統(tǒng)過(guò)氧化氫酶耐熱性和耐酸堿性較差,這極大地限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用潛力。在之前的研究中,我們篩選并表達(dá)出一種新型的錳過(guò)氧化氫酶GeoMnCAT(GMC),具有較好的耐熱性和耐酸堿性,能在75℃和pH 9.0的反應(yīng)條件下達(dá)到最大酶活力,但其表達(dá)量較低且需要IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。因此尋求更適合GMC表達(dá)的宿主菌株和基因表達(dá)組件以提高酶的表達(dá)是急需解決的問(wèn)題。在本項(xiàng)研究中,錳過(guò)氧化氫酶GMC基因被構(gòu)建于穿梭質(zhì)粒pBS-S內(nèi),并以枯草芽孢桿菌RIK1285作為宿主菌株對(duì)錳過(guò)氧化氫酶GMC進(jìn)行表達(dá)。同時(shí),從信號(hào)肽文庫(kù)中篩選出48種適于錳過(guò)氧化氫酶GMC表達(dá)的枯草芽孢桿菌同源信號(hào)肽(45種Sec信號(hào)肽,3種Tat信號(hào)肽)。隨后選擇3種不同類(lèi)型的啟動(dòng)子(組成型啟動(dòng)子P_(43)、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P_(glv)、時(shí)期特異型啟動(dòng)子P_(aprE))插入到重組穿梭質(zhì)粒中并從中篩選出最適于錳過(guò)氧化氫酶GMC表達(dá)的啟動(dòng)子。結(jié)果顯示,Sec分泌途徑的信號(hào)肽能更高效地促進(jìn)外源蛋白的表達(dá),其中信號(hào)肽yoqH能最大程度提高GMC表達(dá)量至46.08 U/mL。同時(shí),我們通過(guò)SingalP軟件計(jì)算得到不同信號(hào)肽的物理化學(xué)性質(zhì)的參數(shù),并將其與相應(yīng)蛋白分泌水平的進(jìn)行了相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)代表分泌蛋白的N-末端氨基酸序列與信號(hào)肽之間的組合效率的D-score值與表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。在優(yōu)化啟動(dòng)子后,組成型啟動(dòng)子P_(43)能夠最大程度上提高錳過(guò)氧化氫酶GMC的表達(dá)量至143.77 U/ml。同時(shí),誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P_(glv)和時(shí)期特異型啟動(dòng)子P_(aprE)也能夠較大程度上提高錳過(guò)氧化氫酶GMC的表達(dá)分別至115.33 U/mL和107.6 U/mL。相較于在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)出的錳過(guò)氧化氫酶,經(jīng)信號(hào)肽和啟動(dòng)子優(yōu)化的在枯草芽孢桿菌中表達(dá)的錳過(guò)氧化氫酶最高被提升至其4.74倍。這項(xiàng)研究將錳過(guò)氧化氫酶GMC在枯草芽孢桿菌進(jìn)行表達(dá)并通過(guò)分子水平優(yōu)化,將錳過(guò)氧化氫酶的酶活提高至之前由大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的4.74倍。這項(xiàng)工作為錳過(guò)氧化氫酶在工業(yè)的應(yīng)用提供了可能性。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：Q78;Q936
【部分圖文】：

也被稱(chēng)為觸酶（Catalase，簡(jiǎn)稱(chēng) CAT）。過(guò)氧化氫酶以 H2O2作為底物，通過(guò)酶活催化一對(duì)電子的轉(zhuǎn)移進(jìn)而將 H2O2分解成水和氧[2]。Sumner 于 1937 年得到牛肝過(guò)氧化氫酶結(jié)晶之后，生物學(xué)家開(kāi)始嘗試?yán)�用多樣的方式從不同微生物以及�?dòng)物組織中獲取過(guò)氧化氫酶[3,4,5]，如在 1948 年 Pinsent 等首次從藤黃微球菌中提取到了錳過(guò)氧化氫酶。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)氧化氫酶能夠有效除去造紙、醫(yī)藥和紡織工業(yè)中的氧化劑-H2O2[6]可以作為一種替代化學(xué)處理、低成本且無(wú)污染的除 H2O2的方法[6,7]廣泛應(yīng)用于紡織業(yè)、食品工業(yè)、工業(yè)酶催化等。過(guò)氧化氫酶可依據(jù)獲得途徑的不同分為真核過(guò)氧化氫酶和原核過(guò)氧化氫酶，前者大部分來(lái)自于動(dòng)植物組織，后者主要來(lái)源于微生物[7,8]。Goldberg 于 1989 年將過(guò)氧化氫酶按照結(jié)構(gòu)和序列差異劃分為三個(gè)亞群[9,10]，分別為單功能過(guò)氧化氫酶（Typical catalase）、雙功能過(guò)氧化氫酶(Catalase-peroxidase, CAT-POD)和錳氧化氫酶(Mn-catalasee)。同時(shí)，以催化中心結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可分為(1)含鐵卟啉結(jié)構(gòu)的 CAT，又稱(chēng)鐵卟啉酶；(2)含錳離子替代鐵的卟啉結(jié)構(gòu)的 CAT，又稱(chēng)錳過(guò)氧化氫酶(MnCAT)。

圖 3.1 不同分泌途徑的信號(hào)肽注：A, B, C 和 D 分別代表 Sec 依賴(lài)性信號(hào)肽，Tat 依賴(lài)性信號(hào)肽，ABC 依賴(lài)性信號(hào)肽和 P依賴(lài)性信號(hào)肽。箭頭指向切割位點(diǎn)。1.5.2 Sec-SRP 分泌途徑識(shí)別和定位作用。在合成前體蛋白后，細(xì)胞質(zhì)伴侶保證了前蛋白在信號(hào)肽信號(hào)識(shí)別粒子（SRP）識(shí)別之前聚集了易位能力狀態(tài)，并與 SRP 受體 FtsY 結(jié)36]。高度保守的核糖核蛋白復(fù)合物 SRP 由 scRNA 和兩種類(lèi)組蛋白蛋白（HBsu和 Ffh 組成，F(xiàn)fh 是一種與 scRNA 相互作用并形成穩(wěn)定復(fù)合物的含 446 個(gè)氨基的蛋白質(zhì)�？莶菅挎邨U菌的 SRP RNA 含有 Alu 結(jié)構(gòu)域，其通過(guò)與結(jié)合核糖體延伸因子競(jìng)爭(zhēng)來(lái)阻止蛋白質(zhì)生物合成。延遲翻譯使 SRP 有時(shí)間與其膜受體 Fts相互作用。DNA 結(jié)合蛋白 HU1（HBsu 的一部分）被認(rèn)為是細(xì)菌 Alu 結(jié)構(gòu)域一部分[39]。

圖 2.1 穿梭質(zhì)粒 pBE-S 質(zhì)粒圖譜穿梭質(zhì)粒 pBE-S 包含: 2 個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)（ColE ori 和 pUBori）、2 個(gè)抗性基Ampr和 Kanr）、1 個(gè)啟動(dòng)子 PaprE、1 個(gè)信號(hào)肽 aprE、1 段多克隆位點(diǎn)（MSC）.3 枯草芽孢桿菌感受態(tài)制備（1）將宿主菌株枯草芽孢桿菌 RIK1285 的甘油管菌液通過(guò)平板劃線法接種 LB 培養(yǎng)基平板，37℃孵育過(guò)夜，約 16 小時(shí)。（2）用接菌環(huán)挑取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單菌落接種至 2 mL LB 培養(yǎng)基，28℃，0-180rpm 過(guò)夜培養(yǎng)。（3）將步驟（2）中培養(yǎng)液取 50μL 加入 5mL SP I 緩沖液中，37℃，180 rpm。加入 1 小時(shí)后開(kāi)始，每 30 分鐘測(cè)量 OD660 值以確定菌株生長(zhǎng)情況，一旦培養(yǎng)入平臺(tái)期便終止培養(yǎng)。（4）將步驟（3）中培養(yǎng)液取 0.5 ml 加入 4.5 mL SP II 緩沖液中，37℃，9000 rpm 下孵育 90 分鐘。
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本文編號(hào)：2881537