發(fā)布時間：2020-11-13 10:55

　　 所有的好氧生物都需要面臨“如何維持細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)”這一問題。氧自由基(reactive oxygen species,ROS)包括過氧化氫、超氧陰離子自由基、羥基自由基和單線態(tài)氧,是造成細胞內(nèi)氧化壓力過大的重要原因之一,會導(dǎo)致生物大分子(蛋白質(zhì)、DNA和脂類)受損,進而影響細胞生長。細胞內(nèi)的ROS水平既受細胞內(nèi)的新陳代謝影響,又受細胞生長微環(huán)境的影響。目前已知的能夠清除ROS的蛋白酶包括過氧化氫酶、過氧化物還原酶(Peroxiredoxins、Prxs)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase,Gpxs)和一些依賴金屬離子進行氧化還原反應(yīng)的酶,而Prxs因為其催化中心結(jié)構(gòu)的特殊性,對過氧化物更敏感,反應(yīng)更迅速,因此在維持細胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要的作用。相比于其他的能夠清除ROS的蛋白酶,人們對于Prxs的研究起步較晚,并且研究對象主要集中在真核生物,尤其是哺乳動物領(lǐng)域,對于古菌中的Prxs研究較少。而冰島硫化葉菌REY15A作為一種嗜熱嗜酸的泉古菌,其細胞內(nèi)的Prxs是否具有特殊的性質(zhì)和功能尚未可知。因此本課題開展了冰島硫化葉菌REY15A中的Prxs性質(zhì)鑒定和功能分析。首先,我們通過生物信息學(xué)分析,找到了冰島硫化葉菌REY15A中7種被注釋(預(yù)測)的Prxs,分別是SiRe_0067、SiRe_0346、SiRe_0725、SiRe_0977、SiRe_1643、SiRe_2162、SiRe_2592,其中 SiRe_1643和 SiRe_2162是類Prxs家族,本課題沒有開展進一步研究。我們分析了其余5種Prxs在古菌中的保守性,預(yù)測它們的活性位點。通過序列比對,我們發(fā)現(xiàn)SiRe_0067、SiRe 0346、SiRe_0725和SiRe_2592在古菌中的保守性較強,并且它們的催化位點滿足PXXXT/SXXCp(Cp是催化活性位點的半胱氨酸)的序列。然后,構(gòu)建了在大腸桿菌與硫化葉菌中蛋白表達的質(zhì)粒,表達純化了野生型和活性缺失突變Prxs。接下來,我們對這些Prxs的體外性質(zhì)進行了鑒定,以過氧化氫和叔丁基過氧化氫為底物,鑒定了這5種Prxs蛋白是否具有過氧化物酶活性并比較還原能力強弱的差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SiRe_0346、SiRe_0067與SiRe 2592能夠與過氧化氫和叔丁基過氧化氫發(fā)生氧化還原反應(yīng),具有較強的反應(yīng)活性,而且C42是SiRe_0067的催化活性位點,C45/50是SiRe_2592的催化活性位點。以單鏈DNA、雙鏈環(huán)狀DNA、雙鏈線性DNA為底物,鑒定這些蛋白是否具有與DNA相結(jié)合的能力以及影響其與DNA結(jié)合的因素分析,我們發(fā)現(xiàn)SiRe_0067和SiRe_0067-C42S(活性缺失突變體)能與DNA結(jié)合,SiRe_0067的氧化還原狀態(tài)能夠影響其DNA結(jié)合能力,被過氧化氫氧化后的SiRe_0067不能與DNA結(jié)合。鑒定了這些Prxs是否能夠保護DNA免受羥基自由基(ROS中毒性最強的活性氧自由基)的損傷,我們發(fā)現(xiàn)SiRe_0067、SiRe_0346、SiRe_0725和SiRe_2592能夠在一定程度上保護DNA免受羥基自由基的攻擊,其中SiRe_0346的保護能力最強。接著,我們通過體內(nèi)過表達這5種Prxs,分析蛋白過表達是否會對細胞生長造成影響,我們發(fā)現(xiàn)只有SiRe_0067過表達會使細胞生長趨勢變慢,其余Prxs過表達對細胞生長沒有明顯影響。鑒定當細胞遭受氧化壓力時,Prxs蛋白的過表達能否保護細胞免受氧化損傷,我們發(fā)現(xiàn)SiRe_0346展現(xiàn)出了較強的保護細胞免于氧化壓力的作用。最后,對基因組上編碼的Prxs的C末端原位添加6×組氨酸標簽,通過Western-Blot實驗進一步分析Prxs在正常狀態(tài)下的細胞內(nèi)的含量差異以及當細胞遭受氧化壓力時,Prxs的表達水平的變化。在體外性質(zhì)鑒定的實驗中,SiRe_0346展現(xiàn)出了能夠高效地還原過氧化氫、叔丁基過氧化氫和羥基自由基的反應(yīng)活性;在體內(nèi)實驗中,SiRe_0346能夠在一定程度上提高細胞抵抗氧化壓力的能力,由此,我們認為SiRe_0346在冰島硫化葉菌REY15A中是維持細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的主要Prxs,而這一結(jié)果也與Sulfolobus bolfatarocus P2被UV處理后,SS02121(SiRe_0346的同源蛋白)的轉(zhuǎn)錄水平翻倍相符合。在體外實驗中,SiRe_0067與SiRe_2592也展現(xiàn)出了一定的清除過氧化物和自由基的能力,因此它們很可能在冰島硫化葉菌REY15A中作為備份蛋白存在,當SiRe_0346不能發(fā)揮作用時能夠保持細胞免受氧化壓力的損傷。考慮到SiRe_0067的獨特性質(zhì),作為Prxs中唯一一個具有DNA結(jié)合能力,并且唯一一個過表達后能夠影響細胞生長的蛋白,我們推測SiRe_0067可能參與到細胞內(nèi)的氧化信號傳導(dǎo)途徑,而SiRe_0067的氧化還原狀態(tài)能夠參與調(diào)節(jié)其功能。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q936;Q933
【部分圖文】：

據(jù)ＣＲ存在與否與反應(yīng)機理的差異對Ｐｒｘｓ的分類。ＰｒｘｓＣｙｓ?（ａ），非典型的?２－Ｃｙｓ?（ｂ）與?１－Ｃｙｓ?Ｃｃ）??１?Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｐｒｅｓ?ａｃｃｏｒｄｉｎｇ?ｔｏ?ｗｈｅｔｈｅｒ?Ｃｒ?ｅｘｉｓｔｓ?ｏｒ?ｎｅａｃｔｉｏｎ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．?Ｐｒｘｓ?ｉｎｃｌｕｄｅ?２－Ｃｙｓ?（ａ）．?ａｔｙｐｉｃａｌ?２－ＣｙＣｙｓ?（ｃ）??，根據(jù)過氧化氫在細胞內(nèi)的含量以及扮演的角色，Ｐｒｅ。首先，當過氧化氫含量過高，能夠?qū)�細胞造成損傷還原，降低其毒害作用，維持細胞穩(wěn)態(tài)６Ｑ。其次，當中作為信號分子或是第二信使，進而引發(fā)下游反應(yīng)時，信號的傳遞者“，因為Ｐｒｘｓ與過氧化氫有著較高的親應(yīng)速度與敏感度遠遠高于“下游蛋白”，被氧化的Ｐｒｘｓ是一種更為有效的“氧化信號傳導(dǎo)機制？。而且，據(jù)６２

００６７－Ｃ４２Ｓ－ｎｏ－ｈｉｓ，以及冰島硫化葉菌??表達質(zhì)粒?ｐＳｅＳＤ－ＳｉＲｅ＿２５９２－ｎｏ－ｌｉｉｓ、ｐＳｅＳＤ－ＳｉＲｅ—２５９２－Ｃ－ｈｉｓ、ｐＳｅＳＤ－ＳｉＲｅ—２５９２－??Ｃ４５／５０Ｓ－Ｃ－ｈｉｓ，圖３．１顯示構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)過酶切驗證的結(jié)果，并且以下所有質(zhì)??粒都測序驗證正確。其中基因片斷的長度如下：５０＾＿００６７為４５０匕卩，??ＳｉＲｅ＿０３４６Ｓ?６４８?ｂｐ，ＳｉＲｅ＿０７２５?Ｓ４６２?ｂｐ，ＳｉＲｅ＿０９７７Ｓ?４３２?ｂｐ，?ＳｉＲｅ＿２５９２??為?４７１?ｂｐ。??我們所選用的大腸桿菌表達載體ｐＥＴ２２ｂ?（質(zhì)粒示意圖參見附錄八），全長??５４９３?ｂｐ，插入目的基因的位置在多克隆位點的ＴＷｆｅｌ?（２８８）與＆／／Ｉ?（１７９）??之間。冰島硫化葉菌的表達質(zhì)粒ｐＳｅＳＤ?（參見附錄八），全長８４３４?ｂｐ，目的基??因插入在ＡＷｅｌ?（７７）與＆／Ｉ?（１８４）之間。??ｌｌｉｌｉｉ?ｉｆ??圖３．１表達質(zhì)粒的酶切驗證結(jié)果??Ｆｉｇ．?３．１?Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｐｌａｓｍｉｄｓ?ｂｙ?ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｖｅ??ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ??圖３．１表示當質(zhì)粒構(gòu)建完成后用ＡＷｅ?Ｉ與■＆／１進行雙酶切驗證的結(jié)果

（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ?２００）分離純化之后得到純的ＳｉＲｅ＿００６７－ｎｏ－ｌｉｉｓ蛋白。圖３．２Ａ表示??分子篩分離得到圖譜，圖３．２Ｂ是對圖３．２Ａ中的第８－１３管ＳＤＳ－ＰＡＧＥ驗證結(jié)果，??其中Ｃ表示樣品經(jīng)過陽離子交換柱分離，濃縮之后得到的蛋白。濃縮９－１３管，??液氮凍存，－８０°Ｃ保存。??３．３．２．２從大腸桿菌中純化ＳｉＲｃ＿００６７－Ｃ４２Ｓ??同ＳｉＲｅＪＫ＾Ｔ－ｎｏ－ｈｉｓ的純化過程類似，熱處理之后的上清樣品經(jīng)過陽離子??交換柱和分子篩分離純化之后得到純的活性缺失突變體蛋白ＳｉＲｅ＿００６７－Ｃ４２Ｓ。??２２??
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1 鐘晴;冰島硫化葉菌REY15A中過氧化物還原酶的性質(zhì)鑒定和初步遺傳分析[D];山東大學(xué);2019年

本文編號：2882112