發(fā)布時間：2020-11-13 23:30

　　 作為一種天然催化劑,酶在催化過程中具有高底物特異性、高產(chǎn)物特異性和高催化效率等特點。然而,在酶較為復(fù)雜的分離純化過程中,易失活以及無法回收再利用等缺點也嚴(yán)重限制了其在工業(yè)應(yīng)用的發(fā)展。以克服上述酶的缺陷并發(fā)揮酶的優(yōu)異性能為目的,本研究提出了一種高效的分離純化及固定化的集成化方法來實現(xiàn)這一目的。構(gòu)建并表達(dá)了兩種含有融合蛋白標(biāo)簽的β-葡萄糖苷酶(GLEGB,GLEH)。一方面利用ELP標(biāo)簽的溫度響應(yīng)行為,實現(xiàn)目標(biāo)酶分子的一步快速分離純化;另一方面利用GB、His標(biāo)簽來強化目標(biāo)酶在載體材料上的固定化。具體內(nèi)容如下:(1)設(shè)計并通過全基因合成了由ELP純化標(biāo)簽和石墨烯結(jié)合多肽標(biāo)簽的雙標(biāo)簽重組β-葡萄糖苷酶質(zhì)粒pET-GLEGB,由ELP標(biāo)簽和6His標(biāo)簽組成的的二元標(biāo)簽重組β-葡萄糖苷酶質(zhì)粒pET-GLEH。通過雙酶切及PCR驗證后證明了重組質(zhì)粒被成功構(gòu)建,通過基因測序得到了正確的DNA序列。(2)將β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)入到受體菌BL21中并在25°C下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將得到的含有目的酶的粗酶裂解液利用ELP對鹽度及溫度的敏感性,在25°C,不同濃度的(NH_4)_2SO_4的條件下進(jìn)行ITC純化重組酶,并根據(jù)酶活回收率及純化倍數(shù)確定最優(yōu)的(NH_4)_2SO_4濃度為0.5 M。使用一次ITC純化得到的目的酶的回收率為97.2%,該方法明顯優(yōu)于商業(yè)化Ni-NTA親和層析純化法的80.6%。(3)利用GB標(biāo)簽的強疏水性,使之與疏水性的碳材料產(chǎn)生較強的吸附力,從而實現(xiàn)通過簡單的物理吸附法將GLEGB穩(wěn)定地固定化于載體材料界面。GLEGB在載體材料GO和C_3N_4表面的固載量分別能達(dá)到698.2 mg g~(-1)和527.3 mg g~(-1)。同時,ELP標(biāo)簽還提高了β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性,當(dāng)在60°C下水浴30 min后,游離GLE和GLEGB剩余的相對酶活分別為45.6%和56.3%,而游離Glu只有4.0%。含有ELP和GB標(biāo)簽的游離酶及固定化酶的貯藏穩(wěn)定性和重復(fù)使用性都有了明顯的提升。(4)為了進(jìn)一步提高固定化酶的操作穩(wěn)定性和循環(huán)利用性能,利用生物礦化固定化酶技術(shù)將重組酶GLEH固定化于由納米級的層狀花瓣自組裝形成的微米級有機-無機雜化納米花中。利用6His標(biāo)簽和Cu~(2+)配位作用,將純化后的GLEH直接進(jìn)行生物礦化,合成了復(fù)合磷酸銅納米花GLEH-NF。對比Cu~(2+)濃度、酶濃度、制備溫度和時間的變化對復(fù)合納米花GLEH-NF形貌及催化性能的影響,并提出了復(fù)合納米花的形成機理。利用超聲波輔助法在15 min內(nèi)即可實現(xiàn)高固載率(81.2%)和酶活回收率(90.3%)。GLEH-NF和游離酶相比,具有129%的相對酶活。通過該方法制備的固定化酶具有高穩(wěn)定性,重復(fù)使用16次后,仍可保留近70%的初始酶活。
【學(xué)位單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q814
【部分圖文】：

圖 1.1 酶工程的一般過程Fig. 1.1 Flow chart of enzyme engineering一般來說，酶工程的第一步就是根據(jù)需要從自然界中篩選找到目的酶。自然界巨大的生物資源寶庫，蘊含著極其豐富的微生物。在每克土壤中含有超過一億，而每種微生物所含的酶也是各不相同。據(jù)統(tǒng)計，自然界超過七千種酶，而這辨識和歸類的就有超過兩千余種[20]。如果通過篩選得到的微生物所產(chǎn)生的酶在性等方面無法滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求，則需要使用定點突變，化學(xué)修飾等方法對行分子級別的改造。將改造好的酶分子基因?qū)�入到微生物中，通過人工培養(yǎng)發(fā)量的目的酶。同時，為了滿足對一些大分子量的底物進(jìn)行有效催化，不僅需要集后破碎獲得粗提液，而且還要分離純化后得到純酶才能將其應(yīng)用到工業(yè)，農(nóng)衛(wèi)生，能源開發(fā)和環(huán)保等領(lǐng)域。 酶的分離純化

重組酶的設(shè)計合成、分離純化及固定化白(Elastin-like polypeptide，ELP)是一種重要的人工合成的多單元 Val-Pro-Gly-Xaa-Gly 串聯(lián)組成，其中 Xaa 稱為“客座氨基酸（脯氨酸除外）[36]。根據(jù)其序列、鹽濃度的不同，ELP 有不P 都有其特定的相轉(zhuǎn)變溫度 Tt(Inverse temperature transition中呈可溶的狀態(tài)，當(dāng)環(huán)境溫度高于其 Tt時，ELP 會變成不可溶變過程如圖 1.2 所示，sELP 是 ELP 處于介質(zhì)溫度低于 Tt時溶液溫度溫度超過 Tt時溶解度變得越來越低。不溶性 ELP淀，從而使其與其他蛋白質(zhì)分離。然后，含 iELP 的沉淀物溶解在緩沖液中[40]。

圖 1.3 傳統(tǒng)酶的固定化方法：(a)吸附法；(b) 共價結(jié)合法；(c) 包埋法；(d)交聯(lián)法Fig. 1.3 Enzyme immobilization methods: (a) cross-linking (b) entrapment (c) physical adsorption (d)chemical bonding method1.4.1.1 吸附法吸附法作為一種最簡單并且最有效的固定化方式，它主要是依靠范德華力、離子相互作用和氫鍵等載體和酶之間產(chǎn)生的分子間作用力來實現(xiàn)酶的固定化。由于分子間的作用力通常比較弱，因此極易發(fā)生酶的脫吸附。分子間的相互作用力一般不會改變酶的空間結(jié)構(gòu)，也不會干擾酶的活性位點，因此該方法對酶的活性影響也最小[51, 52]。用吸附法制備固定化酶具有操作簡單、適用于絕大多數(shù)酶、有較高的酶活回收率、載體成本較低且不需要化學(xué)修飾等優(yōu)勢。但同時也有一定的缺點，如固定化酶的作用力較弱，不穩(wěn)定，酶易從載體材料上脫落污染產(chǎn)物等缺點[53]。如大孔樹脂[54]、介孔硅[55]和分子篩[56]等材料都是吸附法固定酶的常用材料，也是初代工業(yè)化固定化技術(shù)應(yīng)用開發(fā)中的熱門載體。絕大多數(shù)的載體材料都可以通過吸附法固定化酶，然而并不是全部的酶都能通過吸附法固定到這些材料上。要使得酶能夠被成功通過吸附法固定化，首先也是必須要滿足的條件就是該酶能夠和載體材料產(chǎn)生足夠的吸
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2882787