發(fā)布時(shí)間：2020-11-16 14:41

　　 昆蟲E93轉(zhuǎn)錄因子是蛻皮激素下游的初級(jí)應(yīng)答因子之一,在昆蟲由蛹向成蟲變態(tài)發(fā)育期間發(fā)揮著重要作用。E93既參與調(diào)控昆蟲變態(tài)期間幼蟲組織的細(xì)胞程序性死亡,同時(shí)也調(diào)控成蟲組織器官的形成。但目前有關(guān)E93調(diào)控成蟲組織器官形成的分子機(jī)制的研究還很少。E93最早在果蠅中被鑒定到,其在預(yù)蛹期和蛹期特異性表達(dá);在蛹變態(tài)期,果蠅幼蟲器官如唾液腺和中腸等發(fā)生凋亡,而翅原基卻經(jīng)歷劇烈的形態(tài)變化過程最終發(fā)育為成蟲的翅。基于蛹期翅的劇烈變態(tài)發(fā)育及成蟲翅表型易于觀察等優(yōu)點(diǎn),翅常作為研究器官發(fā)育的理想模型。在本研究中,我們以果蠅為模式生物探究了E93轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控翅發(fā)育的分子機(jī)制。采用Gal4/UAS系統(tǒng)對(duì)果蠅E93基因進(jìn)行翅特異性RNAi后觀察表型,利用ChIP-seq數(shù)據(jù)分析篩選E93下游的潛在作用靶標(biāo),并通過在細(xì)胞及組織水平的分子生物學(xué)檢測(cè)和個(gè)體水平的表型觀察,最終解析了E93轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控果蠅翅發(fā)育的分子機(jī)制。取得的主要研究結(jié)果如下:1.果蠅E93基因的翅特異RNAi對(duì)翅發(fā)育的影響為了探究果蠅翅中E93的表達(dá)對(duì)翅發(fā)育的影響,我們采用Gal4/UAS系統(tǒng)對(duì)果蠅E93基因進(jìn)行翅特異性RNAi。本實(shí)驗(yàn)中共選用了4種果蠅翅特異性Gal4品系(nubbin-Gal4、MS1096-Gal4、ptc-Gal4和en-Gal4)和2種E93基因RNAi品系(V104390和#57868)。首先,利用Gal4/UAS系統(tǒng)檢測(cè)了4種翅特異性Gal4在翅中的表達(dá)模式。通過將翅特異性Gal4品系的處女蠅分別與表達(dá)紅色熒光蛋白的UAS-Cherry品系的雄蠅雜交,取其子代翅原基檢測(cè)紅色熒光蛋白的表達(dá)部位。結(jié)果顯示,nubbin-Gal4驅(qū)動(dòng)紅色熒光蛋白在整個(gè)翅囊區(qū)表達(dá);MS1096-Gal4驅(qū)動(dòng)紅色熒光蛋白在背區(qū)(D區(qū))的翅囊區(qū)表達(dá);en-Gal4和ptc-Gal4分別驅(qū)動(dòng)紅色熒光蛋白在翅原基后區(qū)(P區(qū))和前區(qū)/后區(qū)(A/P)分界處表達(dá)。我們選取表達(dá)范圍最廣的nubbin-Gal4分別與果蠅E93基因的兩種RNAi品系(V104390和#57868)及相應(yīng)的對(duì)照品系進(jìn)行雜交,并取其子代翅原基通過RT-PCR和qRT-PCR檢測(cè)E93基因的表達(dá)。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,E93基因的翅特異性RNAi導(dǎo)致翅中E93的表達(dá)水平顯著降低。表型觀察和統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,果蠅E93基因的翅特異性RNAi引起成蟲翅變小和翅脈發(fā)育異常,兩組中E93基因RNAi后的翅面積分別減少了76.2%和82%。另外,我們利用MS1096-Gal4、ptc-Gal4和en-Gal4這三種翅特異性Gal4分別與E93基因RNAi品系V104390進(jìn)行雜交,其子代同樣表現(xiàn)出了翅變小和翅脈缺陷的表型。以上結(jié)果表明,E93在果蠅翅發(fā)育過程中發(fā)揮著極為重要的調(diào)控作用。2.基于ChIP-Seq數(shù)據(jù)篩選果蠅E93的潛在靶基因?yàn)榱私馕鯡93調(diào)控果蠅翅發(fā)育的分子機(jī)制,我們對(duì)果蠅E93在翅中的ChIP-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析,以篩選E93的潛在靶基因。全基因組定位分析顯示,28.51%的E93 ChIP峰位于基因啟動(dòng)子區(qū)(定義為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000bp的區(qū)域),共對(duì)應(yīng)1868個(gè)基因;43.96%的E93 ChIP峰位于內(nèi)含子區(qū);13.65%的E93 ChIP峰位于基因間區(qū)。鑒于轉(zhuǎn)錄因子常通過與靶基因啟動(dòng)子區(qū)的關(guān)鍵DNA基序結(jié)合發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,我們重點(diǎn)關(guān)注了啟動(dòng)子區(qū)分布有E93 ChIP峰的1868個(gè)基因。GO功能注釋顯示,1868個(gè)基因中的513個(gè)基因富集于翅原基-翅變態(tài)這一生物學(xué)進(jìn)程。進(jìn)一步基于果蠅翅在蛹變態(tài)發(fā)育期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),分析了這513個(gè)基因在化蛹后6 h、18h、24 h、36 h和44 h共五個(gè)時(shí)間點(diǎn)的翅中的協(xié)同表達(dá)變化。根據(jù)其不同的表達(dá)模式,共聚類為8個(gè)簇,其中E93基因位于簇2中,其表達(dá)變化趨勢(shì)為在預(yù)蛹期開始逐漸上調(diào)表達(dá),直至化蛹后24 h表達(dá)水平達(dá)到最高,而后表達(dá)又逐漸降低;513個(gè)基因中共有60個(gè)基因在蛹期具有和E93類似的表達(dá)模式。進(jìn)一步對(duì)這60個(gè)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析,4條與翅發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路被富集,分別為:Dpp、MAPK、Notch和Hippo信號(hào)通路;4條信號(hào)通路中共富集到Dpp、Tkv、Sog、Nej、Numb、Ser、Wts、Baz、Kibra、Cka、Cic、Ttk共12個(gè)基因。3.果蠅E93調(diào)控翅發(fā)育的分子機(jī)制在基于ChIP-Seq數(shù)據(jù)篩選得到的果蠅E93的潛在靶基因中,我們注意到編碼Dpp信號(hào)通路配體的Dpp基因被富集且在蛹期的表達(dá)變化與E93類似,鑒于Dpp信號(hào)通路在果蠅翅發(fā)育過程中的重要作用已有廣泛報(bào)道,我們選擇了Dpp基因作為E93的潛在靶基因進(jìn)行了深入探究。通過果蠅基因組數(shù)據(jù)庫FlyBase檢索發(fā)現(xiàn),果蠅Dpp基因共有4種亞型,分別為Dpp-RA、Dpp-RB、Dpp-RC和Dpp-RE。這4種亞型具有不同的啟動(dòng)子區(qū),但經(jīng)剪切加工后編碼相同的蛋白產(chǎn)物。ChIP-Seq數(shù)據(jù)顯示,在Dpp基因啟動(dòng)子區(qū)共存在6個(gè)E93 ChIP峰。Dpp-RA和Dpp-RB的啟動(dòng)子區(qū)各有兩個(gè)峰,根據(jù)其距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的遠(yuǎn)近分別命名為Dpp-RA-D(D,遠(yuǎn)端)和Dpp-RA-P(P,近端)、Dpp-RB-D和Dpp-RB-P;在Dpp-RC和Dpp-RE的啟動(dòng)子區(qū)各有一個(gè)E93 ChIP峰。果蠅S2細(xì)胞中的ChIP-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,E93與Dpp啟動(dòng)子區(qū)的6個(gè)ChIP峰均能直接結(jié)合。我們利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析了果蠅E93對(duì)Dpp啟動(dòng)子活性的調(diào)控作用。結(jié)果顯示,E93過表達(dá)顯著上調(diào)了Dpp-RA和Dpp-RC亞型啟動(dòng)子的活性,但對(duì)Dpp-RB和Dpp-RE亞型的啟動(dòng)子活性無顯著影響。我們隨后檢測(cè)了E93對(duì)Dpp-RA和Dpp-RC亞型不同截短形式的啟動(dòng)子活性的影響,結(jié)果顯示,E93過表達(dá)同樣可誘導(dǎo)只含有近端ChIP峰的Dpp-RA啟動(dòng)子(Dpp-RA-P)的活性;但將Dpp-RA和Dpp-RC亞型啟動(dòng)子上的ChIP峰區(qū)域全部截除后,E93過表達(dá)對(duì)其啟動(dòng)子活性不再有顯著影響。以上結(jié)果表明,E93可以與Dpp啟動(dòng)子直接結(jié)合并激活其啟動(dòng)子活性。我們進(jìn)一步分析了果蠅E93基因的表達(dá)改變對(duì)Dpp信號(hào)通路基因轉(zhuǎn)錄的影響。qRT-PCR結(jié)果顯示,nubbin-Gal4驅(qū)動(dòng)的E93基因翅特異性RNAi導(dǎo)致翅中Dpp信號(hào)通路關(guān)鍵基因Dpp、Tkv和Mad的表達(dá)下調(diào);在果蠅S2細(xì)胞中過表達(dá)E93則顯著上調(diào)了Dpp、Tkv和Mad的表達(dá)。另外,免疫熒光結(jié)果顯示,果蠅E93基因的翅特異性RNAi抑制了蛹期翅中Dpp的表達(dá),并抑制了其對(duì)下游Mad的磷酸化和激活作用。我們還探究了Dpp信號(hào)通路基因表達(dá)改變對(duì)果蠅翅發(fā)育的影響。用果蠅翅特異的UAS-dicr2;nubbin-Gal4品系分別與Dpp、Tkv、Mad這三個(gè)Dpp信號(hào)通路關(guān)鍵基因的RNAi品系雜交,觀察子代表型。與野生型果蠅的翅相比,對(duì)Dpp、Tkv、Mad基因的翅特異性RNAi均導(dǎo)致成蟲翅顯著減小和翅脈的缺失,這與E93基因翅特異性RNAi所導(dǎo)致的表型類似。綜合分析表明,果蠅E93通過直接正調(diào)控Dpp信號(hào)通路關(guān)鍵基因影響了翅的發(fā)育。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q963
【部分圖文】：

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文空表達(dá)特征E93 基因存在 E93A 和 E93B 兩種亞型，二者具期的 20E 滴度高峰誘導(dǎo)，E93A 和 E93B 在預(yù)，直至化蛹后 24 小時(shí)（h）其表達(dá)量達(dá)到最；在化蛹后 60h 時(shí) E93 表達(dá)再次升高，直至而后又呈現(xiàn)降低趨勢(shì)（圖 1.2）。另外，在家究也表明，E93 具有在蛹期特異性高量表達(dá)的

圖 1.3 E93 在果蠅不同組織中的表達(dá)[14]（30h APF） B.唾液腺（12h APF） C.胃盲腸（3h APF） D.馬氏管（15h A.成蟲中腸（21h APF） F-G.翅（36h APF） H-I.眼（39h APF） APF：化蛹Figure 1.3 Expression of E93 in different tissues of Drosophila[14] APF) B. salivary gland (12h APF) C. gastric caeca (3h APF) D. malpighian tubu midgut (21h APF) F-G.wing (36h APF) H-I.eye (39h APF) APF: after pupari轉(zhuǎn)錄因子的功能研究種轉(zhuǎn)錄因子，在昆蟲中 E93 通過響應(yīng)蛻皮激素信號(hào)繼而調(diào)控時(shí)期特異性轉(zhuǎn)錄，在昆蟲由蛹向成蟲的變態(tài)發(fā)育過程中發(fā)揮道，在完全變態(tài)昆蟲如果蠅和赤擬谷盜中，全身性干涉 E9期不能正常發(fā)育和分化形成成蟲組織和器官，最終導(dǎo)致個(gè)另外，E93 在蛹期的多個(gè)組織中均有表達(dá)并發(fā)揮不同的調(diào)控功能的研究揭示了其在變態(tài)期間幼蟲唾液腺和中腸等組織的重要的調(diào)控功能[10, 17]，并且參與調(diào)控昆蟲變態(tài)發(fā)育期間脂

圖 1.4 E93 在幼蟲中腸細(xì)胞程序性死亡前表達(dá)[17]胃盲腸（三角箭頭）；成蟲中腸上皮細(xì)胞（箭頭）A-D. 果蠅蛹?xì)ば纬珊蟮?2h（A）、4h（B）、6h（C）、13h（D）的中腸。Figure 1.4 E93 protein is expressed in larval midguts prior to programmed cell death[1gastric caeca (arrowheads), adult midgut epithelia (arrows)A-D. Midgut at 2h (A), 4h (B), 6h (C), 13h (D) after puparium formation in Drosophila..2 E93 轉(zhuǎn)錄因子在果蠅唾液腺中的功能果蠅蛹?xì)ば纬杉s 10h 后再次出現(xiàn) 20E 滴度高峰，促進(jìn)其由預(yù)蛹向蛹的3]。與中腸開始凋亡的時(shí)期不同，E93 響應(yīng)蛹期出現(xiàn)的 20E 滴度高峰中開始表達(dá)并促進(jìn)其凋亡[24]。研究表明，E93 可特異性結(jié)合在唾液腺的多個(gè)位點(diǎn)上，這些位點(diǎn)包括蛻皮激素誘導(dǎo)的基因如 E74 和 E75 等，序性細(xì)胞死亡相關(guān)的基因如 dredd、crq 等[17]。另外，在 E93 突變個(gè)體亡相關(guān)的基因如 rpr、hid 和 dronc 等的表達(dá)均出現(xiàn)了下調(diào)。因此，E93 應(yīng)蛻皮激素信號(hào)并調(diào)控下游細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控變態(tài)期間
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本文編號(hào)：2886351