發(fā)布時(shí)間：2020-11-16 22:15

　　 目的:本科室前期通過質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn),DOC-1R(Deleted In Oral Cancer-1 Related)可能與酪蛋白激酶2(Casein Kinase 2,CK2)的α亞基及過氧化物酶1(peroxiredoxin 1,PRDX1)具有相互作用,本研究通過Pull-Down、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-Ip)等方法證實(shí)DOC-1R與CK2α及PRDX1的相互作用,并通過構(gòu)建DOC-1R截短蛋白載體及Pull-Down分別初步探究DOC-1R與CK2α及PRDX1蛋白的結(jié)合區(qū)域,為進(jìn)一步研究DOC-1R的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。研究方法:1 GST Pull-Down分別檢測DOC-1R與CK2α及PRDX1的結(jié)合將轉(zhuǎn)化有pGEX-5X-1及重組載體pGEX-DOC-1R的E.coli BL21菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),所得到的菌體裂解后收集GST蛋白及GST-DOC-1R融合蛋白,與MagneGST particle混勻孵育,加入HEK-293細(xì)胞總蛋白進(jìn)行GST Pull-Down實(shí)驗(yàn),Western Blot分別檢測DOC-1R與CK2α及PRDX1蛋白的結(jié)合情況。2 Co-Ip分別檢測DOC-1R與CK2α及PRDX1的相互作用常規(guī)培養(yǎng)DOC-1R及對(duì)照病毒感染的HeLa細(xì)胞,裂解細(xì)胞獲得總蛋白,分為兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組:分別用FLAG抗體、CK2α抗體或PRDX1抗體進(jìn)行免疫共沉淀反應(yīng),通過Western Blot方法分別檢測DOC-1R與CK2α及PRDX1蛋白的相互作用。3構(gòu)建缺失型DOC-1R原核表達(dá)載體,誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白并通過GST Pull-Down分別檢測DOC-1R與CK2α及PRDX1的結(jié)合區(qū)域以本室前期構(gòu)建的pGEX-DOC-1R質(zhì)粒為模板,分別構(gòu)建pGEX-DOC-1RdelC42、pGEX-DOC-1RdelN42、pGEX-DOC-1RdelN63三種缺失型DOC-1R原核表達(dá)載體。經(jīng)菌落PCR鑒定,擴(kuò)大培養(yǎng)陽性克隆菌落,提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定后對(duì)三種缺失型pGEX-DOC-1R重組表達(dá)載體進(jìn)行DNA測序分析。將編碼序列正確、開放閱讀框架完整的三種缺失型pGEX-DOC-1R重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中,誘導(dǎo)表達(dá)并收集菌液。將菌液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,考馬斯亮藍(lán)染色并脫色以檢測融合蛋白的表達(dá)情況。將新構(gòu)建的三種含有缺失型DOC-1R的大腸桿菌(pGEX-DOC-1RdelC42、pGEX-DOC-1RdelN42、pGEX-DOC-1RdelN63)、本科室前期構(gòu)建及保存的含有缺失型DOC-1R的大腸桿菌(pGEX-DOC-1RdelC63、pGEX-DOC-1RdelC30、pGEX-DOC-1RdelC20、pGEX-DOC-1RdelC7)及對(duì)照菌分別誘導(dǎo)表達(dá),并將得到的菌液裂解,收集融合蛋白,與MagneGST particle混勻孵育,4 h后加入HEK-293細(xì)胞總蛋白混勻孵育過夜,Western Blot分別檢測缺失型DOC-1R蛋白與CK2α及PRDX1的結(jié)合。結(jié)果:1 GST Pull-Down實(shí)驗(yàn)證明DOC-1R分別結(jié)合CK2α及PRDX1蛋白通過Pull-down及Western Blot實(shí)驗(yàn),證實(shí)DOC-1R分別與CK2α及PRDX1蛋白結(jié)合,同時(shí)我們?cè)谙疵撐镏袘?yīng)用CK2β抗體檢測到了CK2β的存在。2 Co-Ip實(shí)驗(yàn)證明DOC-1R分別與CK2α及PRDX1相互作用通過Co-Ip和Western Blot實(shí)驗(yàn),檢測可知DOC-1R分別與CK2α及PRDX1蛋白存在相互作用。3構(gòu)建缺失型DOC-1R原核表達(dá)載體并誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白以分別初步確定DOC-1R與CK2α及PRDX1蛋白結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域截短的DOC-1R片段已經(jīng)成功插入pGEX-5X-1載體中,目的片段序列正確且開放閱讀框架完整,截短的DOC-1RdelN42、DOC-1RdelC42、DOC-1RdelN63在37℃誘導(dǎo)3 h時(shí)均大量表達(dá)。DOC-1R第107-119位氨基酸區(qū)域結(jié)合CK2α蛋白,且DOC-1R第85-126位氨基酸區(qū)域結(jié)合PRDX1蛋白。結(jié)論:1.應(yīng)用GST Pull-Down和Co-Ip技術(shù)證實(shí)DOC-1R分別與CK2α及PRDX1相互結(jié)合。2.應(yīng)用重組技術(shù)及GST Pull-Down技術(shù)證明,DOC-1R與CK2α結(jié)合區(qū)域在DOC-1R的第107-119位氨基酸區(qū)域,DOC-1R與PRDX1蛋白的結(jié)合區(qū)域在DOC-1R的第85-126位氨基酸區(qū)域。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q78
【部分圖文】：

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文取生長狀態(tài)良好的感染了 Lv-DOC-1R 及對(duì)照病毒的人宮頸癌細(xì)胞系 HBS 清洗 3 次，加入 500 μl RIPA 細(xì)胞裂解液，冰上裂解細(xì)胞，將細(xì)胞收集內(nèi)，4℃條件下 12,000 rpm 離心 15 min，吸取上清備用。分為兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別用 Protein G PLUS-Agarose 和 Anti-Flag Affinity Gel 進(jìn)行 Ip 實(shí)驗(yàn)，用相應(yīng)抗體進(jìn)行 Western Blot 檢測，從而確定 DOC-1R 分別與 CK2α及 P互作用。0 缺失型 DOC-1R 引物的設(shè)計(jì)與合成利用人 DOC-1R 基因的 cDNA 序列進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)，5’端引物引入 Bam點(diǎn)，3’端引物包含終止密碼子并引入 XhoⅠ酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了三對(duì)缺-1R 引物，分別缺失 DOC-1R 的第 1-42、85-126、1-63 位氨基酸編碼基因 1）。

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果Pull-Down 結(jié)合 Western Blot 分別證實(shí) DOC-1R 與白在體外存在結(jié)合譜實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果提示 CK2α、PRDX1 可能分別結(jié)合 DOC-1RPull-Down 法分別檢測二者與 DOC-1R 的結(jié)合，用 CK2α抗抗進(jìn)行 Western-Blot 鑒定，結(jié)果顯示在體外，CK2α及 PRDOC-1R 結(jié)合（圖 2，圖 3）。同時(shí)我們?cè)谙疵撐镏袘?yīng)用 CK2存在（圖 2）。

圖 3 在體外 DOC-1R 結(jié)合 PRDX1 蛋白結(jié)合Western Blot分別證實(shí)DOC-1R與CK2α及PRD在相互作用狀態(tài)良好的感染了Lv-DOC-1R及對(duì)照病毒的人宮頸癌細(xì)胞，分為兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別用 Protein G PLUS-Agarose 及ffinity Gel 進(jìn)行 Ip 實(shí)驗(yàn)，在本實(shí)驗(yàn)條件下實(shí)驗(yàn)組中 CK2αC-1R 目的條帶均能被檢測到，而對(duì)照組未檢測出目的蛋白， 分別與 CK2α及 PRDX1 具有相互作用（圖 4，圖 5）。
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本文編號(hào)：2886733