發(fā)布時間：2020-11-18 10:04

　　 家蠶是鱗翅目昆蟲模式生物,其雌雄個體經(jīng)濟價值差異明顯,因此對家蠶性別決定的研究不僅可為鱗翅目害蟲防治提供參考,而且在養(yǎng)蠶業(yè)方面具有產(chǎn)業(yè)應(yīng)用價值。先前研究發(fā)現(xiàn)位于家蠶性別決定信號通路下游的Bmdsx基因是家蠶性別分化開關(guān)基因,Bmdsx的不同選擇性剪接形式?jīng)Q定了家蠶個體性別分化的方向。BmPSI(Byxbom mori P-element somatic inhibitor)蛋白可以特異地結(jié)合上Bmdsx pre-mRNA的第4外顯子CE1元件,促進Bmdsx的雄性特異性剪接。當(dāng)敲除BmPSI基因后,轉(zhuǎn)基因家蠶個體中許多性別調(diào)控關(guān)鍵基因出現(xiàn)表達紊亂,下游最關(guān)鍵的Bmdsx的剪切形式出現(xiàn)變化,雄性個體中出現(xiàn)Bmdsx雌性剪接形式。另外,先前研究者曾構(gòu)建家蠶酵母雙雜交早期胚胎cDNA文庫,并以BmPSI為誘餌篩選文庫,發(fā)現(xiàn)了與BmPSI結(jié)合的剪接體蛋白——BmSPX,我們推測BmSPX可能參與家蠶Bmdsx的選擇性剪切過程。為研究PSI調(diào)控dsx在昆蟲物種間的保守性以及BmPSI互作蛋白BmSPX對下游Bmdsx選擇性剪切的調(diào)控作用,我們設(shè)計實驗方案,獲得以下研究結(jié)果:1.BmPSI結(jié)構(gòu)域與Bmdsx pre-mRNA的結(jié)合活性研究BmPSI蛋白包含4個KH_1結(jié)構(gòu)域,該類結(jié)構(gòu)域為RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,本研究構(gòu)建分別刪除其中1個KH_1結(jié)構(gòu)域的截短蛋白表達載體,純化這4種截短蛋白,將4種截短蛋白和全長BmPSI蛋白分別與CE1 RNA探針進行EMSA結(jié)合實驗。結(jié)果顯示,4個截短蛋白對CE1結(jié)合能力都減弱,其中刪除了第一個和第二個KH_1結(jié)構(gòu)域的2個截短蛋白與CE1結(jié)合能力最弱,這表明家蠶BmPSI蛋白結(jié)合CE1的能力由4個KH_1結(jié)構(gòu)域共同提供,其中前面兩個KH_1結(jié)構(gòu)域起主要作用。2.BmPSI蛋白結(jié)合CE1關(guān)鍵氨基酸位點的發(fā)現(xiàn)及驗證將4個KH_1結(jié)構(gòu)域氨基酸序列進行多序列比對,根據(jù)前兩個KH_1中保守氨基酸位點篩選影響B(tài)mPSI結(jié)合CE1探針的潛在關(guān)鍵氨基酸位點。同時基于先前文獻報道,KH_1活性主要受內(nèi)部保守鋅肽重復(fù)序列Ile-Gly-X2-Gly-X2-Ile(IGGI)影響,本研究對BmPSI結(jié)合RNA能力的7個潛在關(guān)鍵氨基酸位點分別進行突變,過量表達并純化這7種突變的全長BmPSI蛋白。將突變蛋白和CE1序列的RNA探針分別進行EMSA實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中I116G、L127G和mut IGGI這三種突變蛋白的結(jié)合能力明顯減弱,利用EMSA冷競爭實驗證實結(jié)合特異。利用圓二色光譜技術(shù)檢測突變蛋白二級結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示三種突變蛋白與野生型BmPSI蛋白相比無明顯結(jié)構(gòu)差異,同時采用ITC(等溫滴定量熱法)對突變蛋白與CE1探針的結(jié)合親和常數(shù)進行測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這三種突變的引入都使BmPSI蛋白結(jié)合CE1探針的能力顯著減弱。3.PSI結(jié)合dsx pre-mRNA在斜紋夜蛾中的保守性研究為研究PSI蛋白與CE1調(diào)控元件結(jié)合在鱗翅目昆蟲中的保守性,本研究開展了家蠶以外的鱗翅目昆蟲的PSI蛋白研究�；�于斜紋夜蛾基因組計劃已經(jīng)完成,本研究分析了斜紋夜蛾基因組中雙性基因(Sldsx)的序列信息,結(jié)果顯示Sldsx的CE1元件序列與家蠶中序列完全相同。然后,對斜紋夜蛾SlPSI基因進行克隆,構(gòu)建表達載體并純化該蛋白。將SlPSI蛋白與CE1探針進行EMSA結(jié)合實驗,結(jié)果顯示SlPSI蛋白與CE1探針結(jié)合。根據(jù)家蠶BmPSI突變位點信息,對SlPSI相同氨基酸位點進行突變,后利用EMSA實驗比較突變蛋白與CE1探針的結(jié)合能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中I116和IGGI兩種位點對SlPSI蛋白結(jié)合RNA的能力具有重要的影響,而L127位點的突變對SlPSI結(jié)合CE1能力無明顯影響。本研究結(jié)果表明PSI蛋白與dsx pre-mRNA中CE1元件的結(jié)合在鱗翅目昆蟲中具有一定的保守性。4.家蠶BmPSI結(jié)合蛋白BmSPX的功能研究先前研究表明家蠶性別決定關(guān)鍵蛋白BmPSI可與剪切體蛋白BmSPX結(jié)合,為進行BmSPX的功能研究,本實驗首先利用piggyBac轉(zhuǎn)基因增量表達載體構(gòu)建piggyBac-BmSPX重組載體,通過胚胎顯微注射獲得家蠶BmSPX增量表達品系Over-BmSPX,通過多代連續(xù)飼養(yǎng)及熒光篩選獲得穩(wěn)定攜帶紅色熒光的轉(zhuǎn)基因品系。提取轉(zhuǎn)基因個體基因組,對轉(zhuǎn)基因插入情況進行檢測,發(fā)現(xiàn)BmSPX插入位點在第11號染色體基因間區(qū)。通過轉(zhuǎn)基因個體cDNA實時熒光定量PCR檢測,發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因雄性個體中,BmSPX表達量上調(diào)了約30倍;而在雌性轉(zhuǎn)基因個體中,BmSPX表達量上調(diào)了約4倍。綜上結(jié)果可知,我們獲得了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因BmSPX增量表達品系。對發(fā)育至蛾期的轉(zhuǎn)基因增量表達BmSPX家蠶進行表型觀察,同時觀察到內(nèi)生殖器和外生殖器的發(fā)育紊亂現(xiàn)象。因此我們推斷BmSPX基因在雌、雄家蠶性別分化過程中均發(fā)揮重要作用。為研究BmSPX在家蠶性別決定中的生理功能,我們對Over-BmSPX轉(zhuǎn)基因品系進行分子水平檢測,檢測到伴隨BmSPX基因表達的明顯上調(diào),BmMasc、BmIMP和Bmdsx-F等基因表達量發(fā)生明顯變化。同時,將BmSPX基因克隆到pSL1180過表達載體中,利用家蠶BmE細胞對家蠶BmSPX和BmPSI兩種蛋白進行CO-IP(免疫共沉淀)實驗,證實兩者在家蠶細胞環(huán)境下存在相互作用。利用家蠶胚胎細胞系BmE細胞進行亞細胞定位,發(fā)現(xiàn)BmSPX蛋白屬于核質(zhì)穿梭蛋白。由于BmSPX具有精巢組織特異表達的性質(zhì),這與家蠶性別決定關(guān)鍵基因BmMasc精巢特異高量表達的情況一致,因此,我們利用CO-IP實驗證明:BmSPX蛋白確實與BmMasc蛋白存在相互作用關(guān)系。結(jié)合轉(zhuǎn)基因品系Over-BmSPX檢測及以上其他實驗結(jié)果,我們推斷BmSPX蛋白作為Bmdsx雄特異性剪切阻遏復(fù)合體中的蛋白組分參與Bmdsx的選擇性剪切。同時,BmSPX蛋白表達量的積累能夠造成家蠶性別決定級聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控變化,引起上游BmMasc、BmIMP的表達上調(diào)進而促進Bmdsx的雄特異性剪切,進而促進家蠶個體的雄性化發(fā)育。綜上所述,本論文對家蠶性別決定關(guān)鍵蛋白BmPSI參與Bmdsx選擇性剪接的關(guān)鍵氨基酸位點進行鑒定,首次發(fā)現(xiàn)除保守鋅肽重復(fù)序列Ile-Gly-X2-Gly-X2-Ile外對KH_1結(jié)構(gòu)域結(jié)合RNA能力具有顯著調(diào)控作用的關(guān)鍵氨基酸位點I116,并發(fā)現(xiàn)PSI蛋白對雙性基因dsx pre-mRNA關(guān)鍵元件CE1的結(jié)合在鱗翅目昆蟲中具有一定保守性;通過多種分子手段證明可與BmPSI結(jié)合的家蠶剪接體蛋白BmSPX在家蠶性別決定中具有重要作用,使得家蠶性別決定級聯(lián)調(diào)控進一步完善。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q963
【部分圖文】：

路定果蠅性別發(fā)育，該信號首先向下作用鍵開關(guān)基因[25]。性指數(shù)為 1 的信號向下使雌性果蠅個體早期表達 sxl 蛋白，而 sxl 蛋白[26, 27]。之后，sxl 建立性啟動子發(fā)揮作用，sxl 基因開始轉(zhuǎn)錄出 pre-mR的活性 SXL 蛋白的影響，前體 mRNA 中 SXL 蛋白；而在雄性果蠅個體中，無法中的活性 SXL 蛋白可以向下傳遞信號至re-mRNA 的 3’剪切位點，促使有活性的的雄性個體中，TRA 蛋白的翻譯提前終因是果蠅性別決定下游開關(guān)基因，雌性雌特異性剪切[32, 33]，果蠅個體發(fā)育為雌，dsx 基因產(chǎn)生雄特異性剪切，果蠅個體

圖 1.2 P 元件 pre-mRNA 的不同組織細胞中的有效剪切（引自 Chmiel，2006）Fig 1.2 Productive spilicing of P-element pre-mRNA in germline cells and somatic cells1.3 家蠶的性別決定與果蠅不用，家蠶是典型的ZW染色體決定性生物，雄性個體染色體為ZZ雌性個體性染色體為ZW型，W染色體的存在與否決定了家蠶性別發(fā)育的方向[經(jīng)過多年的研究，除性別決定下游開關(guān)基因 dsx 的選擇性剪切決定性別分化的家蠶的性別決定通路與果蠅相比存在較大不同[50]。Bmdsx 基因作為家蠶性別關(guān)鍵開關(guān)基因在各組織均有表達，只是存在表達形式上的差異。Bmds

圖 1.3 Bmdsx 的性別特異性選擇性剪切Fig .1.3 Sex-specific alternative splicing of Bmdsx蠶性別通路蠶體內(nèi)共 28 對染色體，雌性性染色體為 ZW 異配型，雄性性染色。W 染色體上存在由大量轉(zhuǎn)座子控制元件和重復(fù)序列，因此很難鑒上的基因[58, 59]。Fem 基因就是在 W 染色體上發(fā)現(xiàn)的強雌性化作用性別決定的初始信號[60]。性染色體為 ZZ 的雄性家蠶個體中，促雄性化因子— BmMasc 基因調(diào)控雄性個體的劑量補償效應(yīng)，且促進 Bmdsx 的雄特異性剪接，雄性。而雌性家蠶性染色體為 ZW 型，只存在于雌性個體中的 W Fem 基因擔(dān)任家蠶性別決定的初始信號[61]，該基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA 可與 BmMasc 基因 mRNA 中的一個區(qū)段互補配對，使 BmMasc[62, 63]，降解過程中產(chǎn)生一個 28nt 的 BmMasc-piRNA，這兩種 piRNAi 兩種蛋白的輔助下相互降解對方基因的 mRNA[64, 65]，最終到到了[66]
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李淑云;王子龍;顏偉玉;;蜜蜂性別決定相關(guān)基因的研究進展[J];蜜蜂雜志;2015年02期

2 楊海;胡建宏;李青旺;;哺乳動物性別決定與性別控制研究進展[J];廣東農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年18期

3 劉智棋;李婉;唐森威;李劍勇;楊東波;楊毅;;溫度依賴型性別決定在爬行動物中的研究進展[J];四川動物;2012年04期

4 何川;孟和;;雞性別決定與分化分子機制研究進展[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報;2011年06期

5 袁聿軍;;哺乳動物性別決定機制的研究進展[J];生物學(xué)通報;2010年10期

6 周林燕 ,張修月 ,王德壽;脊椎動物性別決定和分化的分子機制研究進展[J];動物學(xué)研究;2004年01期

7 王慧超,朱勇,夏慶友;黑腹果蠅的性別控制[J];遺傳;2003年01期

8 朱必才,高建國,張子峰,王秀琴,張永,高俊芳;哺乳動物性別決定及其機制的研究[J];細胞生物學(xué)雜志;2002年05期

9 王磊;鐘生泉;林健榮;;雄蠶研究的進展[J];廣東蠶業(yè);1998年02期

10 李有泉,王海蓉;蚜蟲和蝗蟲的性別決定初探[J];蒙自師范高等專科學(xué)校學(xué)報;1997年04期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 王歌;雄性表型性反轉(zhuǎn)雞穩(wěn)定性及性別決定相關(guān)基因表達的研究[D];華南農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

本文編號：2888597