發(fā)布時(shí)間：2020-11-18 19:15

　　 第一部分:高原低氧適應(yīng)藏、漢DNA甲基化譜研究研究背景:青藏高原環(huán)境缺氧,氣溫低,降水量少和紫外線輻射強(qiáng),生存條件惡劣。藏族人與當(dāng)?shù)仄渌�民族和移居高海拔的居民相比能很好地適應(yīng)高原環(huán)境,表現(xiàn)在夜間睡眠時(shí)具有較高的通氣形狀參數(shù)值和低通氣反應(yīng),他們不僅動(dòng)脈血氧飽和度較低,而且血紅蛋白濃度較低、睡眠質(zhì)量較好。據(jù)相關(guān)報(bào)道,藏族人體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶的含量高于當(dāng)?shù)仄渌��?這就可以解釋藏族人肺部較強(qiáng)的氧氣擴(kuò)散能力和明顯增多的血流量。此外,藏族人對(duì)缺氧環(huán)境的適應(yīng)性具有可遺傳特征,如嬰兒出生體重,運(yùn)動(dòng)后兒童和成人的血氧飽和度和血紅蛋白水平。所有這些因素都使藏族能夠適應(yīng)并生活在高海拔地區(qū)。Simonson,TS等人研究發(fā)現(xiàn),EGLN1和PPARA的單倍型與藏族人所特有的血紅蛋白B表型呈現(xiàn)顯著正相關(guān)。Beall CM和Yi X等報(bào)道EPAS1是經(jīng)歷了高陽性選擇的高原適應(yīng)的候選基因。Simonson TS,Wang GD和Yang L等人的研究證明EDNRA和YES1參與高海拔適應(yīng)。然而,DNA甲基化作為重要的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制,很少有研究人員報(bào)道DNA甲基化水平的基因表達(dá)與缺氧適應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)。Bernard Thienpont等人報(bào)道,腫瘤組織發(fā)生缺氧可引起氧依賴性TET酶的活性降低,TET酶通過5-甲基胞嘧啶氧化進(jìn)而催化DNA去甲基化。這種生物學(xué)現(xiàn)象可以說明DNA甲基化與缺氧是相關(guān)的。Chiranjib Dasgupta等也提供引起啟動(dòng)子甲基化可增加缺氧的證據(jù)。研究方法:本研究,我們招募了 10名世居高海拔藏族(5名男性和5名女性;平均年齡:27.5歲),10名居民低海拔藏族(5名男性和5名女性;平均年齡:29.9歲),10名移居高海拔漢族(5名男性和5名女性;平均年齡:36.8歲)和10名普通漢族人(5名男性和5名女性;平均年齡:30.2歲)。使用基于微陣列的方法,找出世居藏族和移居漢族的差異性甲基化區(qū)域(DMR),通過京都基因與基因組百科全書(KEGG)對(duì)差異甲基化基因進(jìn)行分析,對(duì)差異基因進(jìn)行生物通路富集分析(IPA),并對(duì)其功能采用基因功能富集分析(Go)。結(jié)果:差異甲基化位點(diǎn)的KEGG分析提示,高海拔藏族與低海拔藏族在致心律失常性右心室心肌病,肥厚性心肌病,擴(kuò)張型心肌病信號(hào)通路富集。移居高海拔漢族與低海拔漢族居民獨(dú)特富集在:胰島素信號(hào)通路和mTOR信號(hào)通路。啟動(dòng)子水平的KEGG分析提示,糖酵解/糖原異生通路是高海拔藏族居民與低海拔藏族居民比對(duì)后獨(dú)有的。結(jié)論:揭示了世居高海拔藏族與移居低海拔藏族和移居高海拔漢族與低海拔漢族的全基因組DNA甲基化譜。此外,對(duì)差異甲基化位點(diǎn)和啟動(dòng)子水平的相應(yīng)差異甲基化基因進(jìn)行典型的功能注釋分析。為探討高原藏族居民與居民低海拔藏族和遷徙高原漢族與居民低海拔漢族人群DNA甲基化的表觀遺傳調(diào)控提供有價(jià)值的信息,為了解高原適應(yīng)的機(jī)制提供新的見解和思路。第二部分:健康成人急性高原暴露后腦血管反應(yīng)性的變化研究研究目的:研究健康成人不同海拔地區(qū)腦血管反應(yīng)性(CVR)的變化及可能相關(guān)機(jī)制。研究方法:采用經(jīng)顱多普勒聯(lián)合CO2吸入CVR,采用近紅外光譜(NIR)檢測局部腦氧飽和度(rScO2)。采集血液標(biāo)本,使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清血管活性物質(zhì)。本研究將59名健康成人分為低海拔組、中海拔組和高海拔組3組,低空組的所有指標(biāo)均在出發(fā)前24小時(shí)和到達(dá)后測試。北京(海拔44.4米)到西寧(中等海拔2200米)。然后,休息48h后,所有指標(biāo)在到達(dá)西寧后(24h和48h)(在2200米的中海拔高度)與玉樹結(jié)古鎮(zhèn)(海拔3700米)和中海拔高度進(jìn)行了檢測。對(duì)三個(gè)海拔高度的受試者進(jìn)行組間比較。北京(海拔44.4米)到西寧(中等海拔2200米)。然后,在休息48小時(shí)后,所有指標(biāo)在西寧(中等海拔2200米)到達(dá)玉樹結(jié)古鎮(zhèn)(海拔3700米)的24小時(shí)和48小時(shí)以及中等高度的所有指標(biāo)進(jìn)行測試。對(duì)三個(gè)高度的受試者進(jìn)行了組間比較。結(jié)果:急性暴露于高原,低海拔組CVR升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(CVR:1.94re為0.91±0.53,P0.001);CVRI升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(腦血管儲(chǔ)備指數(shù)(CVRI):3.65 HVCVR 與 1.37 E CVR,P0.001);rSc02 水平隨海拔升高而降低,差異是(66.78±4.61)%vs(70.29±4.52)%,P0.001。急性高原暴露后低海拔組血管活性物質(zhì)與暴露前相比下降:NO:(79.14±9.54)μmol/L vs(58.01±9.93)μ mol/L,P0.001;血清e(cuò)NOS水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(77.23±6.20)pg/mL v(65.07±9.82)pg/ml,P0.001;EPO:(84.68±13.16)PG/ml 與(65.01±5.92)pg/ml,P0.001;VEGF:(71.91±11.62)pg/ml vs(54.92±11.86)pg/ml,P0.001;SFLT:(384.18±42.73)pg/ml vs.(320.62±78.96)pg/ml,p78.96。急性高原暴露后中海拔組CVR增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(CVR:2±0.79 vs 0.91±0.66,P0.001);CVRI 差異顯著(3.83±0.67 vs 1.67±0.87);P0.001;RSC02隨海拔升高而略有下降,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(67.53±4.61)%vs.(69.63±5.59)%,P0.001]。在暴露于高海拔地區(qū)之前,NO、NOS低、中海拔組的EPO、VEGF和sFLT均高于高原組。不同海拔高度的CVR水平與SC02呈負(fù)相關(guān)(r=0.91),與NO和NOS水平呈正相關(guān)(RS=0.89,r=0.75);CVR 與 VEGF 和 EP0 中度相關(guān)(RS=0.45,r=0.42)。RSC02 與 RBC、Hb 和 VEGF 水平呈正相關(guān)(r=0.89,r=0.75,RS=0.86),但與 NO 和 NOS水平呈中度負(fù)相關(guān)(rs=-0.52,r=-0.57)。結(jié)論:低海拔受試者快速高原低氧暴露后,CVR升高,血清中的NO、eNOS、EPO等紅細(xì)胞和血管活性物質(zhì)顯著升高,VEGF升高,隨后逐漸降低,sFlt-1隨著海拔的升高,逐漸升高,rSc02水平逐漸降低,表明高海拔地區(qū)的局部腦缺氧。第三部分:高原適應(yīng)性基因MICU1在造血分化過程中的功能研究研究目的:根據(jù)前期研究結(jié)果藏、漢全基因組DNA甲基化譜,分析差異甲基化基因富集到的通路,我們選擇鈣信號(hào)通路,低氧適應(yīng)相關(guān)線粒體鈣離子攝入蛋白1進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。低氧可誘發(fā)低氧誘導(dǎo)因子HIF活化降低線粒體膜電位,活化的HIF進(jìn)一步激活一系列因子引起線粒體自噬。線粒體膜電位降低后被自噬體清除,誘導(dǎo)線粒體自噬發(fā)生。線粒體功能紊亂導(dǎo)致鈣穩(wěn)態(tài)失衡,將引起細(xì)胞自噬、死亡。線粒體鈣離子單向轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體(MCU、MICU1、MICU1)中線粒體鈣離子攝入蛋白1(MICU1)是維持細(xì)胞線粒體鈣穩(wěn)態(tài)的重要分子,它是線粒體依賴性死亡途徑的負(fù)調(diào)控因子。有研究發(fā)現(xiàn),人在進(jìn)入高原后,MCUR1的表達(dá)水平顯著升高,提示MCUR1可能在適應(yīng)高原環(huán)境過程中發(fā)揮作用。那么復(fù)合體中MICU1的功能如何?為此我們構(gòu)建了穩(wěn)定敲低MICU1的K562細(xì)胞系,并鑒定了載體的表達(dá)效果,探索MICU1在低氧時(shí)對(duì)紅系分化的功能及其可能機(jī)制。探討在低氧環(huán)境中MICU1對(duì)紅系分化過程中調(diào)節(jié)作用及其對(duì)K562增殖、分化及凋亡的影響。研究方法:采用Western blot方法檢測K562細(xì)胞系MICU1蛋白的表達(dá)情況。用慢病毒技術(shù)包裝K562細(xì)胞,穩(wěn)定敲低MICU1的表達(dá),常氧、低氧培養(yǎng),用qRT-PCR檢測MICU1敲低效果,以及紅系分化標(biāo)志物cd235a、γ-globin表達(dá)情況,達(dá)標(biāo)后采用westemblot檢測MICU1、P53、BAX、Bcl-2的表達(dá)情況;用CCK8法檢測了敲低MICU1后K562細(xì)胞的增殖;用ANNEXINV-APC/7-ADD檢測了敲低MICU1后K562細(xì)胞系的周期和凋亡。結(jié)果:低氧可以抑制K562細(xì)胞的CD35a、y-globin的表達(dá),抑制紅系分化;CCK-8結(jié)果表明敲低MICU1可顯著抑制K562細(xì)胞的增殖能力;流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明敲低MCUR1可促進(jìn)K562細(xì)胞凋亡;蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明敲低MICU1促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白p53、BAX的表達(dá),抑制BCL-2的表達(dá)。說明MICU1可促進(jìn)K562增殖,抑制K562凋亡,促進(jìn)了紅系分化。結(jié)論:我們結(jié)果說明在K562細(xì)胞模型中,MICU1可以調(diào)控K562向紅系分化,調(diào)控增殖、分化及凋亡過程,其調(diào)控K562分化、凋亡的過程可能通過調(diào)控MICU1的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。這進(jìn)一步確定了 MICU1低氧誘導(dǎo)細(xì)胞紅系分化的可能新機(jī)制。
【學(xué)位單位】：青海大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R339.5
【部分圖文】：

吸取單個(gè)核細(xì)胞層（即血清與淋巴細(xì)胞分離液之間的公透明層）并移至另一只新的 15ml 離心管中。（5）公入 5ml 的 PBS，吹勻，離心 1000rpm，5min，RT，棄上清液，公入2ml 的紅細(xì)胞裂解液，吹勻，離心 1000rpm，5min，RT，棄上清液，公入 5ml 的PBS，吹勻，離心（1000 轉(zhuǎn) 5 分鐘），棄上清液。（6）二次離心后可見離心管管底部白色團(tuán)塊狀沉淀，棄上清，公入 2mlPBS分裝到兩個(gè) EP 管，再次離心后，棄上清，標(biāo)記管壁-80℃冰箱保存�；�因組 DNA提�。菏褂� TIANampGenomicDNAKit（TiangenBiotech，Beijing，China）根據(jù)制造商的說明從血液中獲得基因組 DNA。1.3.2 甲基化芯片 850K 檢測(1)檢測原理Illumina 的 Infinium 的甲基化檢測技術(shù)原理是單堿基延伸原理，源于前期的SNP 檢測。

（A/T 和 C/G）在捕獲探針上進(jìn)行單堿基延伸，只有公 gDNA 發(fā)生互補(bǔ)結(jié)合的探針才能得到延伸；通過染色， A/T 和 C/G 將分別標(biāo)記公同的熒光染料；（9）芯片掃描，并利用軟件根據(jù)兩種熒光判讀并輸出甲基化水平結(jié)果。1.3.3 實(shí)驗(yàn)過程（1）樣品質(zhì)檢檢測將基因組 DNA，先用分光光度計(jì)定量，并將樣品調(diào)到標(biāo)準(zhǔn)濃度 50ng/μL，20μL，然后用 0.8%的瓊脂糖凝膠電泳。樣品電泳主帶清晰，通常公小于 10kb，沒有明顯降解，總量 5μg 以上，可進(jìn)行下游的甲基化芯片實(shí)驗(yàn)。使用 NanoDrop2000 分光光度計(jì)（NanoDrop，ThermoScientific，Wilmington，DE，USA）測量提取的 DNA 的濃度。在 0.8％瓊脂糖凝膠電泳中檢查提取的 DNA 的質(zhì)量。僅選擇 DNA 純度為 1.8 至 2.05 的血液樣品用于微陣列研究，結(jié)果如下。

圖 1.4 數(shù)據(jù)分析流程圖3.6 數(shù)據(jù)分析使用 EZDNAMethylationTM 試劑盒（ZymoResearch，Irvine，CA）對(duì)來自個(gè)血液樣品的大約 200 至 500ng 基因組 DNA 經(jīng)過化學(xué)修飾和亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)，其將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，并且甲基化的胞嘧啶在處理期間保持變。Illumina850K 甲基化芯片在經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理后，通過來自 Illumin（aSaniego，CA）的 InfiniumMethylationEPICBeadChip 微陣列根據(jù)制造商的說明測所有受試者的DNA甲基化狀態(tài)，其測量分布在整個(gè)基因組上的853,307個(gè)CpG點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。使用 Illumina iScan 掃描儀提取圖像強(qiáng)度，并在 RnBeads 中制質(zhì)量，RnBeads 廣泛用于大規(guī)模分析和 DNA 甲基化數(shù)據(jù)解釋 56。
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 吳興裕 ,王小珍;模擬高原低氧對(duì)人的認(rèn)知能力影響的研究[J];高原醫(yī)學(xué)雜志;2002年03期

2 仁青次 ,王小珍;高原低氧地區(qū)肺動(dòng)脈CT測量的研究[J];高原醫(yī)學(xué)雜志;2001年03期

3 謝本維,王端榮;高原低氧環(huán)境對(duì)肝功能的影響[J];實(shí)用肝臟病雜志;1999年04期

4 孟憲發(fā);;人體高原低氧適應(yīng)概述[J];青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1987年02期

5 張?jiān)缛A;汪慰寒;王立義;云國華;馮素華;陳素英;;高原低氧環(huán)境與氣虛關(guān)系的探討(Ⅱ)——112例高原反應(yīng)患者STI檢測及中醫(yī)分析[J];中醫(yī)雜志;1988年08期

6 何建;陳芳;李海龍;趙延梅;楊漢青;余長升;馬英;郭新建;;喜馬拉雅旱獺對(duì)高原低氧環(huán)境的生理適應(yīng)性研究[J];野生動(dòng)物學(xué)報(bào);2020年01期

7 劉貴琴;李向陽;;高原低氧條件下的腸道菌群與藥物代謝[J];藥學(xué)研究;2019年12期

8 張秋梅;;高原低氧對(duì)機(jī)體整體的影響及適應(yīng)性分析[J];中外醫(yī)療;2018年11期

9 劉忠;李文華;;高原低氧適應(yīng)遺傳基因與非適應(yīng)者的差異[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年07期

10 邵珂;單體棟;張方信;;高原低氧致胃腸應(yīng)激性潰瘍的研究進(jìn)展[J];胃腸病學(xué);2011年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前8條

1 劉潔;高原低氧適應(yīng)DNA甲基化譜及相關(guān)基因MICU1功能研究[D];青海大學(xué);2019年

2 鄺婷婷;基于HIF-1α信號(hào)通路和代謝組學(xué)研究藏藥蔓菁多糖抗高原低氧的作用機(jī)制[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2019年

3 朱衛(wèi)中;間歇性高原低氧抗心肌缺血再灌注損傷的線粒體機(jī)制研究[D];中國科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2005年

4 張慧;藏族人群高原適應(yīng)關(guān)鍵基因EPAS1和EGLN1的功能研究[D];西藏大學(xué);2017年

5 李鵬;高原低氧環(huán)境對(duì)骨髓造血干細(xì)胞增殖與定向選擇分化的影響及其機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2010年

6 李向陽;高原低氧環(huán)境中磺胺甲噁唑的藥物動(dòng)力學(xué)研究[D];沈陽藥科大學(xué);2010年

7 宋婷婷;系統(tǒng)性炎癥促進(jìn)高原低氧腦水腫的研究[D];浙江大學(xué);2016年

8 高建峰;低氧/低硒對(duì)肉雞肺臟內(nèi)皮素-1和其受體基因表達(dá)的影響[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 韓彥舟;高原低氧環(huán)境下大鼠SAP-LI中P38MAPK的表達(dá)研究[D];青海大學(xué);2019年

2 馬玉梅;高原低氧致大鼠胃黏膜組織細(xì)胞凋亡研究[D];青海大學(xué);2019年

3 寇娜;高原低氧條件下鼠多形螺旋線蟲感染對(duì)小鼠腸道黏膜免疫功能的影響[D];青海大學(xué);2019年

4 馮振龍;高原低氧環(huán)境對(duì)于大鼠心肌微小RNA和mRNA表達(dá)譜的影響及心肌損傷干預(yù)研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2019年

5 周雪姣;高原低氧對(duì)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體MDR1、MRP1和BCRP的影響[D];青海大學(xué);2018年

6 靳衛(wèi)權(quán);高原低氧致大鼠胃黏膜組織細(xì)胞Beclin-1、LC3-Ⅱ水平變化的研究[D];青海大學(xué);2018年

7 郭永博;藏族人群中GCH1基因的適應(yīng)性選擇及其對(duì)高原低氧適應(yīng)的貢獻(xiàn)[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

8 馬文科;高原低氧環(huán)境下神經(jīng)元自噬與損傷的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2017年

9 陳珂;牦牛腦p53適應(yīng)高原低氧的分子機(jī)理[D];蘭州大學(xué);2017年

10 黃君毅;高原低氧性心肌肥厚的中醫(yī)證候分布規(guī)律及相關(guān)性研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2889096