發(fā)布時(shí)間：2020-11-20 19:02

　　 發(fā)育調(diào)節(jié)質(zhì)膜多肽(DREPP)是一類與質(zhì)膜相關(guān)的植物特異性蛋白,具有結(jié)合磷脂酰肌醇磷酸鹽(PtdInsPs)、Ca2+/鈣調(diào)蛋白(CaM)、微管和微絲等功能,在植物生長發(fā)育與逆境應(yīng)答過程中發(fā)揮了重要作用。DREPP應(yīng)答低溫、干旱等逆境的分子機(jī)制已有研究,但是其鹽堿應(yīng)答分子機(jī)理尚未見報(bào)道。本研究以星星草(Puccinellia tenuiflora 為實(shí)驗(yàn)材料,在全基因組范圍內(nèi)分析了 PutDREPP家族組成,并克隆了PutDREPP1和PutDREPP2基因。進(jìn)而利用生物化學(xué)和分子遺傳學(xué)策略分析了PutDREPP1和PutDREPP2基因表達(dá)特性、蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位,及其與Ca2+/CaM的結(jié)合能力,并通過分析PutDREPP1過表達(dá)擬南芥植株初步解析了其在逆境應(yīng)答過程中的生物學(xué)功能。我們利用新近獲得的星星草全基因組數(shù)據(jù)庫,分析了PutDREPP基因家族組成,包括PutDREPP1和PutDREPP2,并克隆到PutDREPP1和PutDREPP2基因。生物信息學(xué)分析表明,PutDREPP1 ORF區(qū)域長度為609 bp,編碼202個(gè)氨基酸;PutDREPP2 ORF區(qū)域長度為651 bp,編碼216個(gè)氨基酸。PutDREPP1和PutDREPP2均具有DREPP家族蛋白功能結(jié)構(gòu)域。星星草PutDREPP1和PutDREPP2分別與水稻(Oryza sativa)的OsDREPP1和OsDREPP2同源性最高。我們利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測到PutDREPP1與PutDREPP2在星星草的根、莖、葉、花、葉鞘、花穗、花柄以及種子中均有表達(dá)。PutDREPP1在根中表達(dá)量最高,花穗中表達(dá)量最低。PutDREPP2在種子中表達(dá)量最高,葉中表達(dá)量最低;在75 mmol/L Na2CO3、100 mmol/L NaHCO3、200 mmo1/L NaCl、10 mmol/L H2O2、160 μmol/L CdCl2 以及 4℃脅迫時(shí),除了根中的PutDREPP1在低溫脅迫時(shí)受抑制表達(dá),其余脅迫條件下葉和根中的PutDREPP1都受誘導(dǎo)表達(dá)。而根和葉中的PutDREPP2在100 mmol/LNaHCO3、200 mmol/L NaCl、160μmol/L CdCl2以及4℃時(shí)都受抑制表達(dá)。這暗示著PutDREPPs可能參與了鹽堿、重金屬、過氧化氫以及低溫等脅迫的應(yīng)答過程。通過構(gòu)建pBI121-PutDREPP1-GFP和pBI121-PutDREPP2-GFP載體,并分別導(dǎo)入煙草(Nicotiana tabacum)葉片細(xì)胞和洋蔥(Allium cepa)表皮細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá),亞細(xì)胞定位結(jié)果表明,正常條件下PutDREPP1和PutDREPP2主要定位于質(zhì)膜。通過PutDREPPs基因原核表達(dá)體系,誘導(dǎo)并純化到His-PutDREPP1和His-PutDREPP2融合蛋白,經(jīng)蛋白免疫印跡法驗(yàn)證了蛋白質(zhì)純度,并利用Ca2+/CaM結(jié)合實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了 PutDREPPs具有Ca2+/CaM結(jié)合能力。通過構(gòu)建過表達(dá)PutDREPP1和PutDREPP2基因植物載體,并利用農(nóng)桿菌侵染法分別獲得過表達(dá)PutDREPP1和PuuDREPP2基因擬南芥植株。對過表達(dá)PutDREPP1基因擬南芥植株的耐鹽性進(jìn)行分析。在100 mmol/L和125 mmol/LNaCl脅迫下,過表達(dá)PutDREPP1基因擬南芥的根長和鮮重都優(yōu)于野生型擬南芥。這表明PutDREPP1可能對鹽應(yīng)答具有正調(diào)控作用。我們的研究結(jié)果為深入認(rèn)識DREPPs調(diào)控逆境應(yīng)答的分子機(jī)制,以及進(jìn)一步研究星星草等鹽生植物鹽堿應(yīng)答分子機(jī)理提供了新的信息。
【學(xué)位單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

?基因的克隆與表達(dá)特性分析??３．１．１?ＰｕｔＤＲＥＰＰｌ?＾（＼?ＰｕｔＤＲＥＰＰ２??利用ＲＮＡ提取試劑盒提取星星草根和葉片的總ＲＮＡ，電泳檢測目的條帶（圖３－１）。??如圖所示，２８Ｓ?ｒＲＮＡ和１８Ｓ?ｒＲＮＡ均有清晰條帶，且２８Ｓ?ｒＲＮＡ條帶亮度大致為１８Ｓ??ｒＲＮＡ的２倍，表明所提ＲＮＡ質(zhì)量良好，可進(jìn)行接下來的實(shí)驗(yàn)。??１?２??圖３－１星星草總ＲＮＡ提取電泳圖??１：根中的ＲＮＡ；?２：葉片中的ＲＮＡ??Ｆｉｇ．?３－１?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｏｆ?Ｐｕｃｃｉｎｅｌｌｉａ?ｔｅｎｕｉｆｌｏｒａ??１：?Ｒｏｏｔ?ｏｆ?ＲＮＡ；?２：?Ｌｅａｆ?ｏｆ?ＲＮＡ??將提取到的星星草根和葉片的總ＲＮＡ，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成ｃＤＮＡ。以葉片??的ｃＤＮＡ為模板，基因特異性引物，進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，電泳檢測到在７００?ｂｐ左右有目的??性特異條帶（圖３－２）。將目的條帶膠回收，連接到ｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔ載體上，轉(zhuǎn)至大腸桿菌??．ＩＭ１０９上，挑取單克隆搖菌，送公司測序。序列正確的菌液提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定??（圖３－３），條帶與基因大小相符，分別命名為ｐＥＡＳＹ－Ｂ

時(shí)期的不同器官，提取總ＲＮＡ反轉(zhuǎn)錄成ｃＤＮＡ為模板，以為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)??熒光定量ＰＣＲ技術(shù)分析尸ｗ／Ｚ）狀ＰＰ／、在星星草不同器官中的表達(dá)特性。??如圖３－８所示，在星星草根、花、種子中的表達(dá)量較高，而在花穗和花??柄中的表達(dá)量較低，但表達(dá)量差異不大。在星星草種子中的表達(dá)量約是葉中??表達(dá)量的１８倍，其表達(dá)量最高，其次是在莖中，在葉中的表達(dá)量最低。??ａ?＞－５?ｂ?４０??３５．??３．０?■??？?１０?丄?丨?室??ｓ?ｉ?１?－ｅ２－５?■??ＳＩ?，，?丄「１?Ｓｈｏ?．??ｓｉ?丄?ｆ?上?ｎ?．．?２．ｓ?ｘ．??＝ｉ〇，?．?［ｔｉ?ｒｉ?［＾１?ｖ?ｗｒ．?？?Ｔ?丄??Ｔ?Ａ由?ｉ〇?－ｎ?丄ｉ內(nèi)ｍ??１?內(nèi)人．．．??０．０?￣Ｌ—＾￣＊—ｌ—１￣■—＊—１￣１￣￣￣￣Ｌ－＊—Ｊ￣００??ｍ?莖?葉珀花穗花柄?花種子?根莖葉?鞀?花穗花柄花?擰子??脅迫時(shí)間?脅迫時(shí)間??Ｓｔｒｅｓｓ?ｔｉｍｅ?Ｓｔｒｅｓｓ?ｔｉｍｅ??圖３－８?Ｐｗ／Ｚ）／？五／ＶＶ和／基因在星星草不同器官中的表達(dá)特性分析??ａ：?ＰｕｔＤＲＥＰＰｌ；?ｂ：?ＰｕｔＤＲＥＰＰ２??Ｆｉｇ．?３－８?Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＰｕｔＤＲＥＰＰｌ?ａｎｄ?Ｐｕ（ＤＲＥＰＰ２?ｉｎ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｏｒｇａｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?Ｐｕｃｃｉｎｅｌｌｉａ??ｔｅｎｕｉｆｌｏｒａ??ａ：?ＰｕｔＤＲＥＰＰｌ；?ｂ：?ＰｕｔＤＲＥＰＰ２??３．２?ＰｕｔＤＲＥＰＰｓ的亞細(xì)胞定位??為觀察ＰｕｔＤＲＥＰＰｌ和ＰｕｔＤＲＥＰＰ２的亞細(xì)胞定位

??圖３－１０?ｐＢｉｍ－Ｚ＾／＾ＥＰ／＾－ＧＦＰ重組質(zhì)粒的酶切鑒定??Ｍ：?ＤＬ１５０００；?１：?ｐＢｉｍ－Ｐｗ／Ｄｉ＾Ｗ－ＧＦＰ?的酶切鑒定?Ｃ％ａＩ／＆７／Ｉ）；?２：?ｐＢｉｍ－Ｐｗ／Ｄ／ｅｆＰ尸２－ＧＦＰ??的酶切鑒定ＣＷａＩ／＆ｃＩ）??Ｆｉｇ．?３－１０?Ｅｍｚｙｍｅｓ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐＢｌ＼２ｌ－ＰｕｔＤＲＥＰＰ２－Ｇ￥Ｐ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ??Ｍ：?ＤＬ１５０００；?１：?ｐＢＩｌ?２?ｌ－／＞ｗ／Ｄ７＾￡，／＞Ｐ２－ＧＦＰ?ｄｉｇｅｓｔｅｄ?ｂｙ?ｅｎｚｙｍｅｓ?（Ｘｂａ?＼／Ｓａｌ＼）；?２：?ｐＢ＼＼２＼－ＰｕｆＤＲＥＰＰ２－ＧＦ？??ｄｉｇｅｓｔｅｄ?ｂｙ?ｅｎｚｙｍｅｓ?（Ｘｂａ?ＭＳａｃ?Ｉ）??３０??
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本文編號：2891852