發(fā)布時間：2020-11-20 19:02

　　 發(fā)育調節(jié)質膜多肽(DREPP)是一類與質膜相關的植物特異性蛋白,具有結合磷脂酰肌醇磷酸鹽(PtdInsPs)、Ca2+/鈣調蛋白(CaM)、微管和微絲等功能,在植物生長發(fā)育與逆境應答過程中發(fā)揮了重要作用。DREPP應答低溫、干旱等逆境的分子機制已有研究,但是其鹽堿應答分子機理尚未見報道。本研究以星星草(Puccinellia tenuiflora 為實驗材料,在全基因組范圍內分析了 PutDREPP家族組成,并克隆了PutDREPP1和PutDREPP2基因。進而利用生物化學和分子遺傳學策略分析了PutDREPP1和PutDREPP2基因表達特性、蛋白質亞細胞定位,及其與Ca2+/CaM的結合能力,并通過分析PutDREPP1過表達擬南芥植株初步解析了其在逆境應答過程中的生物學功能。我們利用新近獲得的星星草全基因組數據庫,分析了PutDREPP基因家族組成,包括PutDREPP1和PutDREPP2,并克隆到PutDREPP1和PutDREPP2基因。生物信息學分析表明,PutDREPP1 ORF區(qū)域長度為609 bp,編碼202個氨基酸;PutDREPP2 ORF區(qū)域長度為651 bp,編碼216個氨基酸。PutDREPP1和PutDREPP2均具有DREPP家族蛋白功能結構域。星星草PutDREPP1和PutDREPP2分別與水稻(Oryza sativa)的OsDREPP1和OsDREPP2同源性最高。我們利用實時熒光定量PCR技術檢測到PutDREPP1與PutDREPP2在星星草的根、莖、葉、花、葉鞘、花穗、花柄以及種子中均有表達。PutDREPP1在根中表達量最高,花穗中表達量最低。PutDREPP2在種子中表達量最高,葉中表達量最低;在75 mmol/L Na2CO3、100 mmol/L NaHCO3、200 mmo1/L NaCl、10 mmol/L H2O2、160 μmol/L CdCl2 以及 4℃脅迫時,除了根中的PutDREPP1在低溫脅迫時受抑制表達,其余脅迫條件下葉和根中的PutDREPP1都受誘導表達。而根和葉中的PutDREPP2在100 mmol/LNaHCO3、200 mmol/L NaCl、160μmol/L CdCl2以及4℃時都受抑制表達。這暗示著PutDREPPs可能參與了鹽堿、重金屬、過氧化氫以及低溫等脅迫的應答過程。通過構建pBI121-PutDREPP1-GFP和pBI121-PutDREPP2-GFP載體,并分別導入煙草(Nicotiana tabacum)葉片細胞和洋蔥(Allium cepa)表皮細胞中進行瞬時表達,亞細胞定位結果表明,正常條件下PutDREPP1和PutDREPP2主要定位于質膜。通過PutDREPPs基因原核表達體系,誘導并純化到His-PutDREPP1和His-PutDREPP2融合蛋白,經蛋白免疫印跡法驗證了蛋白質純度,并利用Ca2+/CaM結合實驗初步證實了 PutDREPPs具有Ca2+/CaM結合能力。通過構建過表達PutDREPP1和PutDREPP2基因植物載體,并利用農桿菌侵染法分別獲得過表達PutDREPP1和PuuDREPP2基因擬南芥植株。對過表達PutDREPP1基因擬南芥植株的耐鹽性進行分析。在100 mmol/L和125 mmol/LNaCl脅迫下,過表達PutDREPP1基因擬南芥的根長和鮮重都優(yōu)于野生型擬南芥。這表明PutDREPP1可能對鹽應答具有正調控作用。我們的研究結果為深入認識DREPPs調控逆境應答的分子機制,以及進一步研究星星草等鹽生植物鹽堿應答分子機理提供了新的信息。
【學位單位】：東北林業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

?基因的克隆與表達特性分析??３．１．１?ＰｕｔＤＲＥＰＰｌ?＾（＼?ＰｕｔＤＲＥＰＰ２??利用ＲＮＡ提取試劑盒提取星星草根和葉片的總ＲＮＡ，電泳檢測目的條帶（圖３－１）。??如圖所示，２８Ｓ?ｒＲＮＡ和１８Ｓ?ｒＲＮＡ均有清晰條帶，且２８Ｓ?ｒＲＮＡ條帶亮度大致為１８Ｓ??ｒＲＮＡ的２倍，表明所提ＲＮＡ質量良好，可進行接下來的實驗。??１?２??圖３－１星星草總ＲＮＡ提取電泳圖??１：根中的ＲＮＡ；?２：葉片中的ＲＮＡ??Ｆｉｇ．?３－１?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｏｆ?Ｐｕｃｃｉｎｅｌｌｉａ?ｔｅｎｕｉｆｌｏｒａ??１：?Ｒｏｏｔ?ｏｆ?ＲＮＡ；?２：?Ｌｅａｆ?ｏｆ?ＲＮＡ??將提取到的星星草根和葉片的總ＲＮＡ，利用反轉錄試劑盒反轉錄成ｃＤＮＡ。以葉片??的ｃＤＮＡ為模板，基因特異性引物，進行ＰＣＲ擴增，電泳檢測到在７００?ｂｐ左右有目的??性特異條帶（圖３－２）。將目的條帶膠回收，連接到ｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔ載體上，轉至大腸桿菌??．ＩＭ１０９上，挑取單克隆搖菌，送公司測序。序列正確的菌液提取質粒，進行雙酶切鑒定??（圖３－３），條帶與基因大小相符，分別命名為ｐＥＡＳＹ－Ｂ

時期的不同器官，提取總ＲＮＡ反轉錄成ｃＤＮＡ為模板，以為內參基因，采用實時??熒光定量ＰＣＲ技術分析尸ｗ／Ｚ）狀ＰＰ／、在星星草不同器官中的表達特性。??如圖３－８所示，在星星草根、花、種子中的表達量較高，而在花穗和花??柄中的表達量較低，但表達量差異不大。在星星草種子中的表達量約是葉中??表達量的１８倍，其表達量最高，其次是在莖中，在葉中的表達量最低。??ａ?＞－５?ｂ?４０??３５．??３．０?■??？?１０?丄?丨?室??ｓ?ｉ?１?－ｅ２－５?■??ＳＩ?，，?丄「１?Ｓｈｏ?．??ｓｉ?丄?ｆ?上?ｎ?．．?２．ｓ?ｘ．??＝ｉ〇，?．?［ｔｉ?ｒｉ?［＾１?ｖ?ｗｒ．?？?Ｔ?丄??Ｔ?Ａ由?ｉ〇?－ｎ?丄ｉ內ｍ??１?內人．．．??０．０?￣Ｌ—＾￣＊—ｌ—１￣■—＊—１￣１￣￣￣￣Ｌ－＊—Ｊ￣００??ｍ?莖?葉珀花穗花柄?花種子?根莖葉?鞀?花穗花柄花?擰子??脅迫時間?脅迫時間??Ｓｔｒｅｓｓ?ｔｉｍｅ?Ｓｔｒｅｓｓ?ｔｉｍｅ??圖３－８?Ｐｗ／Ｚ）／？五／ＶＶ和／基因在星星草不同器官中的表達特性分析??ａ：?ＰｕｔＤＲＥＰＰｌ；?ｂ：?ＰｕｔＤＲＥＰＰ２??Ｆｉｇ．?３－８?Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＰｕｔＤＲＥＰＰｌ?ａｎｄ?Ｐｕ（ＤＲＥＰＰ２?ｉｎ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｏｒｇａｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?Ｐｕｃｃｉｎｅｌｌｉａ??ｔｅｎｕｉｆｌｏｒａ??ａ：?ＰｕｔＤＲＥＰＰｌ；?ｂ：?ＰｕｔＤＲＥＰＰ２??３．２?ＰｕｔＤＲＥＰＰｓ的亞細胞定位??為觀察ＰｕｔＤＲＥＰＰｌ和ＰｕｔＤＲＥＰＰ２的亞細胞定位

??圖３－１０?ｐＢｉｍ－Ｚ＾／＾ＥＰ／＾－ＧＦＰ重組質粒的酶切鑒定??Ｍ：?ＤＬ１５０００；?１：?ｐＢｉｍ－Ｐｗ／Ｄｉ＾Ｗ－ＧＦＰ?的酶切鑒定?Ｃ％ａＩ／＆７／Ｉ）；?２：?ｐＢｉｍ－Ｐｗ／Ｄ／ｅｆＰ尸２－ＧＦＰ??的酶切鑒定ＣＷａＩ／＆ｃＩ）??Ｆｉｇ．?３－１０?Ｅｍｚｙｍｅｓ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐＢｌ＼２ｌ－ＰｕｔＤＲＥＰＰ２－Ｇ￥Ｐ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ??Ｍ：?ＤＬ１５０００；?１：?ｐＢＩｌ?２?ｌ－／＞ｗ／Ｄ７＾￡，／＞Ｐ２－ＧＦＰ?ｄｉｇｅｓｔｅｄ?ｂｙ?ｅｎｚｙｍｅｓ?（Ｘｂａ?＼／Ｓａｌ＼）；?２：?ｐＢ＼＼２＼－ＰｕｆＤＲＥＰＰ２－ＧＦ？??ｄｉｇｅｓｔｅｄ?ｂｙ?ｅｎｚｙｍｅｓ?（Ｘｂａ?ＭＳａｃ?Ｉ）??３０??
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本文編號：2891852