發(fā)布時(shí)間：2020-12-06 05:17

　　細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）是絕大多數(shù)細(xì)胞都能分泌的具有膜結(jié)構(gòu)的囊泡,主要包括微泡（microvesicles,MVs）和外泌體（exosomes）,廣泛分布于人體各種細(xì)胞外液,是細(xì)胞間通訊的重要媒介。EVs選擇性地繼承母細(xì)胞中的脂質(zhì),蛋白質(zhì)和核酸（包括DNA和RNA）,其中microRNA（miRNA）是EVs中研究最多的分子,但目前還沒(méi)有關(guān)于EVs中miRNA表達(dá)譜的系統(tǒng)數(shù)據(jù)資源。EVs在液體活檢方面前景廣闊,目前間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells,MSCs）來(lái)源的EVs是最廣泛的研究對(duì)象之一。MSCs是一種具有多向分化,造血支持等功能的干細(xì)胞,廣泛分布于骨髓,脂肪和臍帶（umbilical cord,UC）等組織,其中臍帶來(lái)源的MSCs（UCMSCs）被證實(shí)具有更強(qiáng)的增殖能力和細(xì)胞干性。MSCs的衰老會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松,組織修復(fù)能力降低以及白血病骨髓瘤療效差等問(wèn)題,因此表征MSCs衰老的標(biāo)志物研究和逆轉(zhuǎn)MSCs衰老效應(yīng)的機(jī)制研究,對(duì)人類健康意義重大。這里,我們系統(tǒng)地研究EVs來(lái)源miRNA表達(dá)譜,利用MSC-MVs表征MS... 

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【部分圖文】：

SEM和TEM下的EVs。圖片來(lái)源:https://en.wikipedia.org.

二代測(cè)序的樣本準(zhǔn)備,是后面數(shù)據(jù)獲取和數(shù)據(jù)分析得到積極結(jié)果的基礎(chǔ)。認(rèn)真做好第一步,比如文庫(kù)準(zhǔn)備,目標(biāo)序列富集和濃縮,每一步的高質(zhì)量完成,都是更精確,也更節(jié)省時(shí)間。通過(guò)細(xì)胞裂解,從細(xì)胞中提取核酸,然后利用物理或者酶促方法將核酸長(zhǎng)片段碎片化,當(dāng)核酸樣本油較短的長(zhǎng)度范圍時(shí)候,測(cè)序結(jié)果最好,后面生物信息比對(duì)也能得到最好的結(jié)果。如果是小RNA的測(cè)序,還會(huì)利用凝膠電泳得到理想的片段長(zhǎng)度。通過(guò)以上片段化和凝膠電泳,得到想要的文庫(kù)。然后利用這個(gè)文庫(kù)制備測(cè)序模板。目前有兩種方法為測(cè)序準(zhǔn)備測(cè)序模板:來(lái)自單個(gè)DNA分子的模板擴(kuò)增和單個(gè)DNA模板。對(duì)于不能檢測(cè)單個(gè)熒光事件的系統(tǒng),需要將DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增。有三種最常見的DNA擴(kuò)增方法,微乳液PCR,橋式擴(kuò)增(詳見圖1.4)和固相納米球擴(kuò)增。這些模板最終是可以隨機(jī)分布在空間網(wǎng)格上。利用DNA文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增得到DNA模板。在擴(kuò)增過(guò)程中,可能會(huì)引入各種錯(cuò)誤,比如富含AT或CG的序列再擴(kuò)增過(guò)程中可能會(huì)引入偏差�，F(xiàn)在有直接用DNA文庫(kù)進(jìn)行單分子測(cè)序。目前有三種方法固定單分子DNA,第一種是將單分子引物共價(jià)連接到固定支持物上,然后將然后將DNA打斷成200-250bp的長(zhǎng)度,并在DNA片段兩端添加adaptor,然后將這些DNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)固定在模板上,以供測(cè)序。第二種方法是,直接將DNA單鏈連接在模板上,然后進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)產(chǎn)生熒光反應(yīng)測(cè)序。第三種是Pacific Biosciences使用的方法,將聚合酶固定在反應(yīng)支持物上,捕獲單鏈DNA分子后,進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)反應(yīng),與前兩種方法不同,第三種方法可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞中的核酸。

基因的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,包括在轉(zhuǎn)錄前的轉(zhuǎn)錄因子蛋白對(duì)其的調(diào)控,以及轉(zhuǎn)錄后miRNA對(duì)其的調(diào)控。上面討論了miRNA和轉(zhuǎn)錄因子分別對(duì)基因的調(diào)控機(jī)理。為了得到更全面的基因調(diào)控圖景,將轉(zhuǎn)錄因子和miRNA對(duì)基因的調(diào)控結(jié)合起來(lái)分析。轉(zhuǎn)錄因子和miRNA與他們共同調(diào)控的靶基因,能夠通過(guò)形成前饋環(huán)(feed-forward loops,FFL)或者反饋回路(feedback loops,FBL)的來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)(詳見圖1.6)[113,114]。FFL按照主要調(diào)控原件,可分為TF-FFL,miRNA-FFL和composite-FFL,其中TF-FFL是以TF主導(dǎo)環(huán)路調(diào)控,miRNA-FLL為miRNA主導(dǎo)環(huán)路調(diào)控,composite-FFL中miRNA和TF調(diào)控作用效果相當(dāng)(詳見圖1.6 a)。相同作用FFLs,是指從主調(diào)控元件出發(fā),最終落腳到基因,兩條路的調(diào)控作用是一樣的,要么是同時(shí)促進(jìn),要么是同時(shí)抑制(詳見圖1.6 b)。不同作用FFL,是指從主調(diào)控元件出發(fā),最終落腳到基因,兩條路調(diào)控作用是相反的(詳見圖1.6 c)。FBL按照負(fù)調(diào)控可分為單個(gè)負(fù)調(diào)控FBL,和雙負(fù)調(diào)控FBL(詳見圖1.6 d)。這種反饋調(diào)節(jié)的方式使得基因表達(dá)的調(diào)控在遇到突變,具有緩沖作用,使得細(xì)胞在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的強(qiáng)烈刺激下,可以進(jìn)行自我保護(hù)[115]。轉(zhuǎn)錄因子和miRNA共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)大體分為FFL和FBL兩大類[114],FFL環(huán)路中包括一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控miRNA或者miRNA抑制轉(zhuǎn)錄因子(可能兩者都存在,也可能只存在一個(gè)調(diào)控),轉(zhuǎn)錄因子對(duì)基因的調(diào)控和miRNA對(duì)基因的調(diào)控[114]。FBL只包含轉(zhuǎn)錄因子和miRNA之間的相互調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子和miRNA共調(diào)控在細(xì)胞周期,細(xì)胞分化和發(fā)育以及各種癌癥和疾病中都有廣泛左右。比如轉(zhuǎn)錄因子E2F家族通過(guò)調(diào)控促進(jìn)DNA合成的基因表達(dá),從而調(diào)控細(xì)胞周期的G1/S期。E2F家族中的E2F1基因,能夠基因miR-17~92的miRNA簇,miR-17~92反過(guò)來(lái)能抑制E2F1的活性[116]。因此,綜合利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和小RNA測(cè)序的測(cè)序數(shù)據(jù),從轉(zhuǎn)錄因子和miRNA共調(diào)控的角度,更大角度的研究細(xì)胞中的調(diào)控。1.5 本研究目的

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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