發(fā)布時(shí)間：2020-11-13 19:01

　　 DNA作為一種由A、T、G、C四種脫氧核苷酸組成的生物大分子,是生物體內(nèi)儲(chǔ)存和傳遞遺傳信息的基因載體,在生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育和遺傳過(guò)程中起到了至關(guān)重要的作用。四種脫氧核苷酸之間遵循經(jīng)典的Watson-Crick堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,即A-T和C-G。由此,在DNA納米技術(shù)領(lǐng)域,DNA成為一種結(jié)構(gòu)可控且穩(wěn)健的納米構(gòu)建材料,依賴其獨(dú)特的可編程性、序列特異性和多樣性,被廣泛應(yīng)用于大尺寸自組裝納米結(jié)構(gòu)、動(dòng)態(tài)DNA納米器件及具備高信號(hào)放大能力的DNA級(jí)聯(lián)體系等�；�于toehold介導(dǎo)的DNA鏈替換原則,DNA分子機(jī)器在生物傳感、邏輯運(yùn)算及疾病診斷與治療等方面展現(xiàn)出突出的應(yīng)用潛力。金納米顆粒作為一種功能性納米材料,由于其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì),優(yōu)異的穩(wěn)定性和生物相容性而受到廣泛關(guān)注。上世紀(jì)九十年代,Mirkin課題組首次報(bào)道了 DNA功能化的金納米顆粒,命名為球形核酸。作為一種功能化的多元共價(jià)DNA-金納米顆粒雙層復(fù)合物,球形核酸同時(shí)具備金納米顆粒內(nèi)核和寡核苷酸外殼的優(yōu)異特性,被廣泛應(yīng)用于體內(nèi)外診斷、細(xì)胞成像、核酸比色檢測(cè)、藥物輸送和超晶格結(jié)構(gòu)組裝等領(lǐng)域。本論文中,通過(guò)結(jié)合熵驅(qū)動(dòng)的DNA催化網(wǎng)絡(luò),我們首先構(gòu)建出一種靈活且肉眼可見(jiàn)的球形核酸聚集體解組裝策略。相比于傳統(tǒng)的直接連接策略,該整合的解組裝策略分為上游的DNA催化網(wǎng)絡(luò)部分和下游的SNA聚集體解組裝部分,上下游體系利用一條引發(fā)鏈作為連接橋梁。在催化鏈(disassembler)誘導(dǎo)的連續(xù)toehold介導(dǎo)的鏈替換過(guò)程中,引發(fā)鏈逐漸從上游DNA催化網(wǎng)絡(luò)中釋放并啟動(dòng)下游球形核酸聚集體的解組裝,通過(guò)肉眼觀察上清液的顏色變化就可實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便的目標(biāo)鏈檢測(cè)。該催化解組裝策略可在較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到低可視檢測(cè)線,體系靈敏度高。在單核苷酸多態(tài)性區(qū)分應(yīng)用上也展現(xiàn)出突出的序列選擇性和競(jìng)爭(zhēng)性,既能清晰地區(qū)分正確目標(biāo)鏈和突變目標(biāo)鏈,也能在高濃度突變目標(biāo)鏈的干擾下成功檢測(cè)出低量的正確目標(biāo)鏈。此外,下游球形核酸聚集體的制備僅僅需要一種球形核酸單體和行使連接作用的自互補(bǔ)DNA雙鏈參與,在室溫條件下就可直接完成自組裝過(guò)程;而且無(wú)需改變?nèi)魏蜗掠吻蛐魏怂峋奂�體結(jié)構(gòu)就可與任意上游DNA催化網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合以實(shí)現(xiàn)特異性檢測(cè)不同的目標(biāo)鏈,以此構(gòu)建出雙輸入“或”邏輯門,展現(xiàn)了在多組分檢測(cè)應(yīng)用上的靈活性和通用性,從而在便攜式DNA診斷試劑盒制造和臨床實(shí)時(shí)檢測(cè)領(lǐng)域顯現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價(jià)值。DNA鍵盤鎖作為一種智能邏輯器件,與實(shí)現(xiàn)密碼安全的順序邏輯相結(jié)合,只能在正確的輸入排列條件下才能完成邏輯運(yùn)算,在分子層面上達(dá)到信息保護(hù)的需求。在第三章的研究中,通過(guò)利用可擴(kuò)展的DNA組合底物作為“正確運(yùn)行組件”和一系列相應(yīng)的DNA雙鏈消除器作為“錯(cuò)誤消除組件”分別對(duì)正確和錯(cuò)誤順序的DNA輸入鏈進(jìn)行處理,我們構(gòu)建了 一種純DNA組分的均相鍵盤鎖策略,只有正確順序的輸入鏈才能實(shí)現(xiàn)解鎖操作。在對(duì)上述兩種組分的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)競(jìng)爭(zhēng)性分別優(yōu)化后,雙輸入、三輸入和四輸入均相DNA鍵盤鎖裝置依次得以構(gòu)建,并展現(xiàn)出優(yōu)異的安全性能。相比于傳統(tǒng)的鍵盤鎖策略都需要借助異質(zhì)固相平臺(tái)來(lái)進(jìn)行輸入信息的分離或傳感,該純DNA組分的均相鍵盤鎖體系利用了 DNA優(yōu)異的可編程性和可擴(kuò)展性,實(shí)現(xiàn)了多輸入信息的一鍋法分析,這將極大地簡(jiǎn)化操作復(fù)雜性,提高實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的靈活性,有利于推動(dòng)更復(fù)雜信息安全體系的構(gòu)建。自從Mirkin課題組利用熱力學(xué)退火方式成功組裝球形核酸形成不同晶型的超晶格結(jié)構(gòu)后,這種經(jīng)典的調(diào)節(jié)反應(yīng)熵變的組裝策略應(yīng)用于晶體構(gòu)建引起了廣泛興趣。在第四章的研究中,通過(guò)將金納米顆粒表面的DNA walker動(dòng)態(tài)行走策略與粘性末端誘導(dǎo)的球形核酸組裝相結(jié)合,我們構(gòu)建了單組分和雙組分球形核酸聚集體,在室溫條件下分別得到了面心立方(fcc)和CsCl晶體結(jié)構(gòu)。首先,確保雙足行走鏈在顆粒表面的動(dòng)態(tài)行走過(guò)程能夠滿足高效的行走效率和穩(wěn)定的行走持久性;其次,DNA walker誘導(dǎo)的球形核酸組裝動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明合適的雙足行走鏈濃度和連接鏈比例可以驅(qū)動(dòng)聚集體形成;然后,采用熱力學(xué)退火方式對(duì)不同種類粘性末端結(jié)合的無(wú)序聚集體進(jìn)行構(gòu)象調(diào)整,減少晶格缺陷,形成了規(guī)則排列的晶體結(jié)構(gòu);最終,不同濃度的雙足行走鏈在金納米顆粒表面的行走結(jié)果表明,當(dāng)濃度較低時(shí),粘性末端在顆粒表面能夠?qū)崿F(xiàn)緩慢結(jié)合,從而促使組裝體系在每一步過(guò)程中均有足夠的時(shí)間切換粘性末端的連接或釋放,達(dá)到一系列接近平衡狀態(tài)。隨著顆粒間相互作用逐步增強(qiáng),整體將達(dá)到自由能最低的穩(wěn)態(tài),從而得到面心立方(fcc)和CsCl晶體結(jié)構(gòu),這極大地推動(dòng)了可編程膠體結(jié)晶在制備復(fù)雜且功能化納米材料和實(shí)現(xiàn)復(fù)雜相行為的潛在發(fā)展。綜上所述,基于toehold介導(dǎo)的DNA鏈替換反應(yīng),本論文利用多種DNA級(jí)聯(lián)體系對(duì)球形核酸的組裝和解組裝進(jìn)行精確調(diào)控,表明其適用于核酸檢測(cè)、單核苷酸多態(tài)性區(qū)分、多輸入邏輯門和超晶格結(jié)構(gòu)組裝,以及可擴(kuò)展的DNA組合底物可實(shí)現(xiàn)純DNA組分的多輸入均相鍵盤鎖體系構(gòu)建,這些結(jié)果充分體現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)策略的優(yōu)勢(shì)和突出的應(yīng)用潛力。
【學(xué)位單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R318;TB383.1
【部分圖文】：

?１?￣?ｈ??ｈ－ＳＮＡ?ｐ－ＳＮＡ??Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ??＼?／?Ｔｒｉｇｇｅｒ?７＾??ＳＮＡ＾ｆ＾?ｅ－?ｄ－?，?ｄ?ｆ??ｒ?１１?＜?１１１１１１１１１?ｍ?１１１１１１１?Ｉ－??＾?ｎ￣ｄ￣?ｐ－ｓｎａ??ｈ－ＳＮＡ??？?２．２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｓｔｒａｔｅｇｙ?ｆｏｒ?ｃａｔａｌｙｔｉｃ?ＤＮＡ?ｃｉｒｃｕｉｔ?ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ?ｖｉｓｉｂｌｅ?ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ?ｏｆ?ＳＮＡ??ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ．??如圖２．２所示，我們?cè)O(shè)計(jì)的ＳＮＡ聚集體解組裝策略分為上游ｔｏｅｈｏｌｄ介導(dǎo)的??鏈替換反應(yīng)驅(qū)動(dòng)的ＤＮＡ催化網(wǎng)絡(luò)部分和下游的ＳＮＡ聚集體解組裝部分，上下??游兩部分通過(guò)上游循環(huán)過(guò)程中釋放的引發(fā)鏈ｔｒｉｇｇｅｒ相連，一旦引發(fā)鏈釋放便會(huì)??引發(fā)下游ＳＮＡ聚集體的解組裝。參照Ｍｉｒｋｉｎ課題組報(bào)道的面心立方（ｆａｃｅ－??ｃｅｎｔｅｒｅｄ?ｃｕｂｉｃ，?ｆｅｅ）晶體結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)策略［｜３５］，該ＳＮＡ聚集體解組裝實(shí)驗(yàn)的下游??體系同樣只有一種ＳＮＡ單體和一種ＤＮＡ雙鏈復(fù)合物（ｄｕｐｌｅｘ?ｌｉｎｋｅｒ）參與，以??３２??

?Ｈ１－ＳＮＡ?Ｏｎｅ?ｓｔｅｐ??＃?Ｍｕ．ｔ，?ｓｔｅｐｓ??，一雜＾■書(shū)??１＊２＊３＊??Ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ?二）ｋ．??／?Ｗ?３１Ｋ６１??＾Ｐ１?Ｉ〔Ｉ??Ｏｒｄｅｒｅｄ?Ｌａｔｔｉｃｅ?ｉｎｋｅｒ＇Ａ??圖?４．２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｄｅｓｉｇｎ?ｏｆ?ａ?ｔｗｏ－ｌｅｇｇｅｄ?ＤＮＡ?ｗａｌｋｅｒ?ｄｒｉｖｅｎ?ｂｙ?ｃａｔａｌｙｔｉｃ?ｈａｉｒｐｉｎ?ａｓｓｅｍｂｌｙ??ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ?ＳＮＡ?ａｓｓｅｍｂｌｙ．??如圖４．２所示，借助催化發(fā)卡組裝實(shí)驗(yàn)方法，我們?cè)冢玻埃睿斫鸺{米顆粒表面??設(shè)計(jì)了雙足ＤＮＡ?ｗａｌｋｅｒ行走策略，通過(guò)逐步緩慢引入金納米顆粒組裝所必需的??粘性末端，驅(qū)動(dòng)有序晶體形成。首先，通過(guò)發(fā)卡鏈Ｈ１與球形核酸表面修飾的ＤＭＡ??單鏈探針發(fā)生堿基互補(bǔ)雜交，在金納米顆粒表面構(gòu)建出發(fā)卡鏈ＨＩ固定的三維行??走軌道，即Ｈ１－ＳＮＡ。其次，雙足行走鏈（ｔｗｏ－ｌｅｇｇｅｄｗａｌｋｅｒ）能夠同時(shí)識(shí)別軌道??上兩個(gè)相鄰的發(fā)卡鏈Ｈ１上ｔｏｅｈｏｌｄ區(qū)域“丨”，在發(fā)生ｔｏｅｈｏｌｄ介導(dǎo)的鏈替換反應(yīng)??后，分別打開(kāi)兩個(gè)發(fā)卡鏈Ｈ１，暴露出發(fā)卡鏈Ｈ１上新的ｔｏｅｈｏｌｄ區(qū)域“３＊”，此過(guò)??程會(huì)將雙足行走鏈固定在金納米顆粒表面。最后，發(fā)卡鏈Ｈ１上新裸露的ｔｏｅｈｏｌｄ??區(qū)域“３＊”會(huì)被另一條發(fā)卡鏈Ｈ２上的區(qū)域“３”特異性識(shí)別，再在鏈替換反應(yīng)后??形成穩(wěn)定的Ｈ１／Ｈ２復(fù)合物的同時(shí)釋放出相鄰軌道上雙足行走鏈中的一足，另一??足仍然固定在金納米顆粒表面行走軌道上。一方面，雙足行走鏈中脫落的一足可??以繼續(xù)與金納米顆粒表面相鄰的發(fā)卡鏈Ｈ１發(fā)生鏈替換反應(yīng)，打開(kāi)新的發(fā)卡鏈Ｈ
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