發(fā)布時(shí)間：2020-11-21 02:06

　　 目的:采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法建立白消安(busulfan,Bu)在Beagle犬體內(nèi)的定量測(cè)定方法,對(duì)白消安在Beagle犬體內(nèi)不同給藥途徑的藥動(dòng)學(xué)特征進(jìn)行評(píng)價(jià);測(cè)定Beagle犬體內(nèi)谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)活性,研究白消安和環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,Cy)對(duì)GST活性的影響,并通過(guò)不同給藥組的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)以及GST活性,從而探討由GST介導(dǎo)的環(huán)磷酰胺對(duì)白消安藥動(dòng)學(xué)的影響,為臨床合理用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1.白消安在Beagle犬體內(nèi)定量測(cè)定方法的建立使用柱前衍生方法,對(duì)白消安進(jìn)行衍生化處理,衍生化試劑為二乙基二硫代氨基甲酸鈉(sodium diethyldithiocarbamate,DDTC),內(nèi)標(biāo)(internal standard,IS)選定為1,5-戊二醇二甲磺酸酯,色譜柱為Diamonsil(Ⅱ)C18柱(150 mm×4.6 mm,5μm),柱溫為30℃,流動(dòng)相為甲醇-水(54:46),流速為1.0 mL·min~(-1),檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm,進(jìn)樣體積為25μL,從專屬性、標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限、精密度和準(zhǔn)確度、萃取回收率、穩(wěn)定性等方面進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,建立白消安體內(nèi)測(cè)定方法。2.白消安在Beagle犬體內(nèi)靜脈注射和口服給藥的藥動(dòng)學(xué)研究成年健康Beagle犬3只,進(jìn)行雙周期交叉試驗(yàn)。白消安以靜脈注射和口服兩種給藥途徑給藥,劑量分別為0.898 mg·kg~(-1)和1.5 mg·kg~(-1)。于犬一側(cè)前肢靜脈埋入留置針采血,血樣經(jīng)37℃水浴30 min,4000 r·min~(-1)離心10 min后得血清樣品。血清樣品經(jīng)蛋白沉淀和衍生化預(yù)處理后,進(jìn)樣分析,測(cè)定白消安血藥濃度,采用非隔室模型,通過(guò)藥動(dòng)學(xué)軟件DAS 3.2計(jì)算靜注和口服給藥的血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(area under the curve,AUC),平均滯留時(shí)間(mean residence time,MRT),表觀分布容積(apparent volume of distribution,V),比較兩種給藥方式的藥動(dòng)學(xué)特征。3.GST活性測(cè)定以及白消安和環(huán)磷酰胺對(duì)GST活性的影響成年健康Beagle犬3只,分別靜注白消安和口服環(huán)磷酰胺,進(jìn)行雙周期交叉試驗(yàn)。白消安靜注劑量為0.898 mg·kg~(-1),環(huán)磷酰胺口服劑量為14.96 mg·kg~(-1)。于給藥后1 h時(shí)采集血清樣品,使用紫外分分光度法測(cè)定樣本GST活性,分析兩種藥物分別對(duì)GST活性的影響。4.白消安和環(huán)磷酰胺聯(lián)用時(shí)的藥動(dòng)學(xué)研究和GST活性測(cè)定成年健康Beagle犬3只,進(jìn)行雙周期交叉試驗(yàn)。給藥方案設(shè)置為Cy預(yù)處理給藥組和Bu/Cy同時(shí)給藥組。Cy預(yù)處理組具體給藥方案為連續(xù)4天口服環(huán)磷酰胺,并于第4天給藥環(huán)磷酰胺1 h后,靜注白消安;Bu/Cy同時(shí)組給藥方案為在30 s內(nèi)靜脈注射白消安和環(huán)磷酰胺。白消安靜注劑量為0.898 mg·kg~(-1)。按照非臨床藥代動(dòng)力學(xué)采血時(shí)間設(shè)計(jì)原則,設(shè)置采血點(diǎn),于犬一側(cè)前肢靜脈埋入留置針采血,血樣經(jīng)蛋白沉淀和衍生化后進(jìn)樣分析,測(cè)定白消安血藥濃度,采用非隔室模型,通過(guò)藥動(dòng)學(xué)軟件DAS3.2計(jì)算Cy預(yù)處理組和Bu/Cy同時(shí)組的藥動(dòng)學(xué)參數(shù),分別與Bu單獨(dú)靜注組的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行比較。并且測(cè)定Cy預(yù)處理組和Bu/Cy同時(shí)組給藥后的GST活性,結(jié)合藥動(dòng)學(xué)結(jié)果,分析環(huán)磷酰胺對(duì)白消安體內(nèi)代謝的影響。結(jié)果:1.白消安在Beagle犬體內(nèi)測(cè)定的方法學(xué)驗(yàn)證經(jīng)HPLC進(jìn)樣分析,白消安的保留時(shí)間為10.2 min,峰形明顯,分離較好,且不受血清其他內(nèi)源性物質(zhì)的干擾;標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=1.6015C-0.1353,R~2=0.9918,在0.1~3.5mg·L~(-1)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;精密度與準(zhǔn)確度、萃取回收率和穩(wěn)定性結(jié)果均符合方法學(xué)要求。2.白消安在Beagle犬體內(nèi)靜注和口服給藥的藥動(dòng)學(xué)結(jié)果白消安口服給藥在(1.00±0.50)h時(shí)可達(dá)最大吸收,峰濃度為(0.81±0.49)mg·L~(-1)。口服給藥的MRT為(2.37±0.84)h,低于靜注組的(1.31±0.07)h,提示白消安靜注時(shí)在體內(nèi)停留時(shí)間較口服時(shí)更短。3.白消安和環(huán)磷酰胺對(duì)體內(nèi)GST活性的影響利用紫外分光光度法分別測(cè)定白消安和環(huán)磷酰胺給藥前后GST活性,結(jié)果顯示白消安給藥前GST活性為(3.874±0.761)nmol?min~(-1)?mL~(-1),給藥后為(4.237±0.778)nmol?min~(-1)?mL~(-1),并無(wú)顯著性差異。環(huán)磷酰胺給藥前GST活性為(4.159±0.922)nmol?min~(-1)?mL~(-1),給藥后為(7.309±0.612)nmol?min~(-1)?mL~(-1),具有顯著性差異,表明環(huán)磷酰胺能夠誘導(dǎo)GST活性,而白消安對(duì)GST活性無(wú)明顯作用。4.白消安和環(huán)磷酰胺聯(lián)用時(shí)的藥動(dòng)學(xué)及GST活性結(jié)果在Cy預(yù)處理給藥組中,AUC_(0-t)為(1.87±0.07)h·(mg·L~(-1)),相比Bu單獨(dú)靜注組減少了44.5%;MRT為(0.98±0.05)h,低于Bu單獨(dú)靜注組的MRT為(1.31±0.07)h。在Bu/Cy同時(shí)給藥組中,AUC_(0-t)為(1.66±0.14)h·(mg·L~(-1)),MRT為(0.96±0.08)h,均低于Bu單獨(dú)靜注組,兩試驗(yàn)組數(shù)據(jù)與Bu單獨(dú)靜注組比較,均具有顯著性差異。提示白消安和環(huán)磷酰胺同時(shí)給藥后,白消安在體內(nèi)的消除速度是加快的。Cy預(yù)處理給藥組和Bu/Cy同時(shí)給藥組的GST活性均高于Bu單獨(dú)靜注組,表明環(huán)磷酰胺通過(guò)誘導(dǎo)GST,使其活性提高,從而導(dǎo)致白消安體內(nèi)代謝加快。結(jié)論:1.建立了白消安在Beagle犬體內(nèi)的HPLC測(cè)定方法,該方法準(zhǔn)確可靠,靈敏度高且易于操作。2.白消安在Beagle犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)結(jié)果顯示,白消安靜注時(shí)在體內(nèi)停留時(shí)間較口服時(shí)更短。3.確定環(huán)磷酰胺可以誘導(dǎo)體內(nèi)GST活性,而白消安無(wú)明顯作用;當(dāng)兩種藥物同時(shí)存在時(shí),受到環(huán)磷酰胺對(duì)于GST的誘導(dǎo)作用,白消安體內(nèi)消除加快。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R965
【部分圖文】：

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文92結(jié)果2.1專屬性Beagle犬空白血清色譜圖見(jiàn)圖1-2A，空白血清+IS色譜圖見(jiàn)圖1-2B，空白血清+IS+白消安標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見(jiàn)圖1-2C，含藥血清+IS色譜圖見(jiàn)圖1-2D。由圖可知，白消安的保留時(shí)間是10.2min，IS的保留時(shí)間是16.1min，二者峰形明顯，血清中的其他內(nèi)源性物質(zhì)不干擾白消安的測(cè)定。圖1-2白消安衍生化測(cè)定色譜圖A：空白血清；B：空白血清+IS；C：空白血清+IS+Bu；D：含藥血清+IS1：Bu衍生化物；2：IS衍生化物；3：DDTC

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文102.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限如圖1-3所示，白消安在濃度為0.1~3.5mg·L-1的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。求得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=1.6015C-0.1353，R2=0.9918。使用該方法在HPLC上測(cè)得的Beagle犬血清中白消安濃度的定量下限為0.1mg·L-1，RSD=2.8%，n=6。圖1-3白消安在Beagle犬血清中測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線2.3準(zhǔn)確度和精密度準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果見(jiàn)表1-3，該分析方法的日內(nèi)和日間精密度在1.3%~8.3%之間，均小于15%，準(zhǔn)確度在-1.0%~9.5%之間，符合生物樣品分析方法的要求。表1-3準(zhǔn)確度和精密度（x±SD，n=6）Bu濃度（mg·L-1）日內(nèi)日間x±SDRSD(%)RE(%)x±SDRSD(%)RE(%)0.20.20±0.012.7-1.00.21±0.014.23.51.01.04±0.098.33.71.10±0.054.69.52.52.51±0.083.30.22.49±0.031.3-0.5

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文172結(jié)果2.1白消安單劑量靜注和單次口服的藥-時(shí)曲線Beagle犬靜脈注射和口服給藥的白消安藥-時(shí)曲線見(jiàn)圖2-1。由圖可知，Beagle犬靜注給藥時(shí)，血藥濃度隨時(shí)間而降低，在4h后低于定量下限�？诜�給予白消安時(shí)，犬No.1-No.3分別于6h、8h和4h血藥濃度低于定量下限，且個(gè)體間有較大的差異。圖2-1Bu單劑量靜注和單次口服給藥的藥-時(shí)曲線（n=3）A：Bu單劑量靜注的藥-時(shí)曲線；B：Bu單次口服的藥-時(shí)曲線2.2白消安單劑量靜注和單次口服的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Beagle犬靜脈注射和口服給藥的白消安藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2-3。表2-3Bu單劑量靜注和單次口服的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（x±SD，n=3）Bu單劑量靜注Bu單次口服AUC0-th·(mg·L-1)3.37±0.181.82±0.45AUC0-∞h·(mg·L-1)4.09±0.532.09±0.41MRTh1.31±0.072.37±0.84#VL·kg-10.50±0.232.26±1.13Cmaxmg·L-11.95±0.210.81±0.49tmaxh0*1.00±0.50*：在靜脈注射中，t=0h血藥濃度最大；#：與Bu單劑量靜注組比較，P<0.05由上表可知，當(dāng)口服白消安時(shí)，在（1.00±0.50）h有最大吸收，達(dá)峰濃度為
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本文編號(hào)：2892351