發(fā)布時間：2017-12-10 05:00

  本文關(guān)鍵詞：番茄GDP-L-半乳糖磷酸酶基因SlGGP-LIKE的功能分析

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【摘要】：番茄起源于熱帶,是喜溫類蔬菜,因此當(dāng)氣溫較低時,番茄生長發(fā)育遲緩,影響莖、葉生長,長時間的低溫環(huán)境則會導(dǎo)致植株死亡。同時,低溫影響根系對磷、鈣、鉀、鎂等營養(yǎng)元素的吸收和利用,使葉片黃化加劇。低溫條件會導(dǎo)致細胞膜透性降低,活性氧增加,酶系功能改變,引起細胞代謝的變化和功能紊亂,發(fā)生低溫生理傷害�？箟难�酸(Ascorbic acid,AsA)又叫維生素C(Vitamin C,Vc),是一種水溶性抗氧化有機小分子,在植物中廣泛存在,參與體內(nèi)活性氧清除,調(diào)控細胞分裂和細胞生長,并可作為某些氧化還原酶的輔酶參與多種生理過程。在人體內(nèi),抗壞血酸是高效的抗氧化劑,可以保護身體免于自由基的威脅,維持免疫功能,提高免疫力。另外,在環(huán)境變化時,番茄極易染病,導(dǎo)致番茄植株萎蔫,黃化矮縮,嚴(yán)重時會造成番茄果實大面積腐爛,從而導(dǎo)致作物減產(chǎn)。GDP-L-半乳糖磷酸酶(GGP)是植物抗壞血酸L-半乳糖途徑合成的關(guān)鍵酶之一。近幾年來在植物衰老和逆境脅迫研究中,抗壞血酸作為生物體內(nèi)對自由基傷害產(chǎn)生的相應(yīng)保護系統(tǒng)成員之一,更引起了人們的研究興趣。因此,研究番茄GGP基因的功能,具有重要的科學(xué)意義。本研究從番茄中克隆了一個細胞核定位的抗壞血酸合成基因(SlGGP-LIKE),并以轉(zhuǎn)反義SlGGP-LIKE的番茄和過表達SlGGP-LIKE的煙草為材料,探討了SlGGP-LIKE基因在耐低溫、病原菌和氧化脅迫等方面的功能。主要結(jié)果如下:(1)從番茄葉片中分離得到SlGGP-LIKE基因(GenBank序列號:XM_004231938.2),該基因全長為2092bp,開放閱讀框為1317bp,編碼438個氨基酸,具有兩個保守區(qū)-HIT(histidine triad)序列和NLS(nuclear localization sequence)序列。預(yù)測分子量為49kDa,該基因位于番茄2號染色體上。(2)RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn),SlGGP-LIKE在番茄的根、莖、葉、花和果實中均有表達,其中,該基因在葉片中的表達量最高。同時,低溫、MV、強光、NaCl、SA和病原菌均可誘導(dǎo)SlGGP-LIKE表達。(3)構(gòu)建SlGGP-LIKE-GFP融合蛋白并瞬時轉(zhuǎn)化本生煙幼苗,通過Confocal觀察發(fā)現(xiàn)SlGGP-LIKE蛋白定位于細胞核。(4)構(gòu)建了pET-SlGGP-LIKE原核表達載體,在大腸桿菌BL21中成功誘導(dǎo)SlGGP-LIKE蛋白表達,制備抗體,效價為1:300,并用于Western blot實驗。(5)將SlGGP-LIKE基因的編碼區(qū)連入含有35S啟動子的pBI121載體,重組構(gòu)建了SlGGP-LIKE的過表達和抑制表達載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化番茄和煙草,獲得反義轉(zhuǎn)基因番茄植株和過表達SlGGP-LIKE的煙草植株。通過PCR、RT-qPCR以及Western雜交的方法對得到的轉(zhuǎn)基因植株進行檢測,結(jié)果表明成功獲得了SlGGP-LIKE過表達和抑制表達的轉(zhuǎn)基因番茄植株和轉(zhuǎn)基因煙草植株。通過進一步對轉(zhuǎn)基因植株的檢測發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)反義番茄AsA含量與野生型番茄相比明顯下降,轉(zhuǎn)正義煙草AsA含量升高了將近兩倍。(6)通過檢測反義株系抗壞血酸合成途徑(L-半乳糖途徑)中其他相關(guān)酶基因的表達量,發(fā)現(xiàn)位于SlGGP-LIKE上游的基因,如GPI和GME基因的表達上調(diào)。特別是GGP基因,表達量明顯上調(diào)。相反的,在SlGGP反義植株中,SlGGP-LIKE表達量上調(diào)不如GGP基因明顯。因此我們推測在L-半乳糖途徑中,兩個基因相比較,GGP的表達更為重要。(7)低溫脅迫下,反義SlGGP-LIKE番茄生長受到抑制的程度更為嚴(yán)重,PSII最大光化學(xué)效率、凈光合速率、P700的氧化狀態(tài)和D1蛋白含量與WT植株相比下降的更為明顯。并且反義植株積累了更多的活性氧,膜脂傷害程度更為嚴(yán)重,葉黃素循環(huán)的脫環(huán)氧程度更低。(8)用丁香假單胞病原菌侵染轉(zhuǎn)基因反義番茄和WT植株后,病原菌對轉(zhuǎn)基因植株的傷害程度明顯小于WT植株。通過臺盼藍染色以及菌落數(shù)量統(tǒng)計結(jié)果,均說明轉(zhuǎn)基因番茄對病原菌的抗性強于WT植株。病原菌侵染后,轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)明顯的H2O2的快速累積的現(xiàn)象。通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn),抗病基因PR1和NPR1基因在轉(zhuǎn)基因植株中表達量明顯高于WT植株,同時轉(zhuǎn)基因番茄株系中水楊酸合成途徑關(guān)鍵基因ICS的表達量明顯高于WT植株。這說明SlGGP-LIKE參與了抗病響應(yīng),并且是通過H2O2作為信號物質(zhì)誘導(dǎo)的水楊酸合成途徑增強了轉(zhuǎn)基因番茄的病原菌抗性。(9)過表達SlGGP-LIKE明顯提高了轉(zhuǎn)基因煙草AsA含量,減少了轉(zhuǎn)基因煙草在氧化脅迫下H2O2和O2?-的積累。與WT植株相比,轉(zhuǎn)基因植株生長狀況更好,葉圓片失綠更輕,并且具有相對較高的PSII最大光化學(xué)效率、凈光合速率和D1蛋白含量。因此,過表達SlGGP-LIKE能夠增強轉(zhuǎn)基因煙草對氧化脅迫的抗性。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q943.2;S641.2

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1 王淑芳,王峻嶺,趙彥修,張慧;膽堿脫氫酶基因的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因番茄耐鹽性的鑒定[J];植物生理學(xué)報;2001年03期

2 鄭雨燕;凌均h，

本文編號：1273175