發(fā)布時(shí)間：2017-12-10 05:25

  本文關(guān)鍵詞：玉米抗紋枯病全基因組差異表達(dá)基因分析及分子調(diào)控機(jī)制研究

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【摘要】：玉米紋枯病是我國(guó)西南玉米產(chǎn)區(qū)主要真菌性病害之一,并且呈逐年加重及加速蔓延趨勢(shì),嚴(yán)重制約玉米產(chǎn)量與品質(zhì)。近幾年來,傳統(tǒng)育種策略與玉米紋枯病分子生物學(xué)研究結(jié)果與成果轉(zhuǎn)化研究已取得一定進(jìn)展,然而相關(guān)抗病基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及調(diào)控機(jī)制尚不清楚。因此,鑒定與篩選抗病差異基因并深入探究玉米紋枯病病原菌浸入過程中復(fù)雜抗病分子機(jī)理仍是當(dāng)前抗病分子育種研究的重點(diǎn)。本研究選取高耐玉米紋枯病自交系R15和高感自交系Ye478為供試材料,立枯絲核菌高致病性融合菌群AG1-IA為致病病原菌,結(jié)合Solexa數(shù)字基因表達(dá)譜與miRNA深度測(cè)序手段,篩選差異表達(dá)基因及轉(zhuǎn)錄因子基因,結(jié)合miRNA原位雜交、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)等方法分析紋枯病脅迫誘導(dǎo)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及miRNA的表達(dá)動(dòng)態(tài),進(jìn)而鑒定差異表達(dá)的miRNA所調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)模式及其基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。主要結(jié)果如下：1.數(shù)字表達(dá)譜(DGE)測(cè)序結(jié)果顯示,處理組與對(duì)照組文庫(kù)中共發(fā)現(xiàn)159532(56.7%)及110518(53.9%)測(cè)序標(biāo)簽可比對(duì)到玉米基因組上；處理組和對(duì)照組文庫(kù)共有21253個(gè)基因表達(dá),其中2個(gè)文庫(kù)均表達(dá)基因18090個(gè),對(duì)照組和處理組分別有19700和19643個(gè)基因表達(dá)；與對(duì)照組比較,處理組共獲得差異表達(dá)基因3230個(gè),其中上調(diào)基因1476個(gè)上調(diào)率為45.7%,下調(diào)基因1754個(gè),占總差異基因總數(shù)的54.3%。2.GO分子功能注釋結(jié)果顯示,差異表達(dá)基因多屬結(jié)合和催化相關(guān)基因,主要參與代謝作用、細(xì)胞過程、刺激應(yīng)答、生物學(xué)調(diào)節(jié)、細(xì)胞機(jī)構(gòu)合成等生物過程。其中,刺激應(yīng)答基因比例較大。KEGG Pathway分析結(jié)果表明,紋枯病侵入誘導(dǎo)大量差異表達(dá)基因主要積累在代謝調(diào)控途徑,植物-病原菌互作途徑,并且參與糖類以及植物激素的合成,特別是淀粉和蔗糖代謝途徑,萜類及類固醇的大量合成,半胱氨酸和蛋氨酸代謝合成等；另外,部分差異基因參與泛素調(diào)控途徑及氧化磷酸化途徑。我們進(jìn)一步選取了類萜生物合成途徑及GA生物合成途徑關(guān)鍵的部分差異表達(dá)基因并且在抗感自交系中進(jìn)行差異基因表達(dá)的驗(yàn)證及分析。3.共確定411差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因,其中紋枯病抗病脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因156個(gè),主要包括轉(zhuǎn)錄因子基因家族ERF(21個(gè))、WRKY(18個(gè))、bHLH(18個(gè))、MYB(16個(gè))、NAC(11個(gè))、C2H2(8個(gè))、bZIP(6個(gè))、GRAS(6個(gè))、ARF(2個(gè))、TCP(2個(gè))、ZF-HD(2個(gè))等；下調(diào)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因245個(gè),主要包括轉(zhuǎn)錄因子基因家族ERF(18個(gè))、WRKY(6個(gè))、bHLH(24個(gè))、MYB(17個(gè))、NAC(8個(gè))、C2H2(14個(gè))、bZIP(18個(gè))、GRAS(10個(gè)),ARF(8個(gè))、HD-ZIP(10個(gè))、SBP(5個(gè))；Mapman功能注釋結(jié)果顯示,差異轉(zhuǎn)錄因子基因主要涉及激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及氧化還原狀態(tài)的內(nèi)穩(wěn)定。4.結(jié)合課題組前期miRNA深度測(cè)序結(jié)果,本研究對(duì)其中顯著差異表達(dá)：miRNA靶基因預(yù)測(cè),并與抗紋枯病DGE數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),結(jié)果顯示DGE數(shù)據(jù)庫(kù)與其miRNA靶基因重合的轉(zhuǎn)錄因子基因家族主要為：SBP、ARF、GRAS、AP2-ERF、MYB、TCP、GRF等。qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示,各差異表達(dá)miRNAs表達(dá)趨勢(shì)與深度測(cè)序結(jié)果基本相符；測(cè)序數(shù)據(jù)表達(dá)量高于qRT-PCR定量差異表達(dá)數(shù)據(jù),是由于其不同的算法所致；差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)趨勢(shì)與數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序結(jié)果基本一致。5.為進(jìn)一步闡明miRNAs靶向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子在玉米紋枯病侵入過程中扮演的重要角色,本研究以Zma-miR393b靶向調(diào)控F-box TIR1轉(zhuǎn)錄因子為切入點(diǎn),對(duì)miRNA393b及其靶標(biāo)F-box TIR1因子進(jìn)行物種進(jìn)化分析及差異表達(dá)分子驗(yàn)證,結(jié)果表明miRNA393b家族在不同植物中具有高度保守性,靶標(biāo)F-box TIR1家族成員在不同的物種中呈現(xiàn)出獨(dú)立的序列進(jìn)化及多樣性；qRT-PCR結(jié)果表明,Zma-miR393b下調(diào)表達(dá)導(dǎo)致其靶基因F-box蛋白積累,進(jìn)而通過參與泛素調(diào)控途徑響應(yīng)病原菌入侵；原位雜交結(jié)果表明紋枯病侵入早期Zma-miR393b初生韌皮部葉鞘顯著表達(dá),隨后深入后生韌皮部維管束鞘和初生木質(zhì)部組織,其后完全侵入周圍組織的初生木質(zhì)部和后生木質(zhì)部組織�；�于前人的研究以及本研究中的一些結(jié)果,我們構(gòu)建了miRNA-TF抗病調(diào)控途徑。我們推測(cè),植物感知紋枯病脅迫處理信號(hào)后,產(chǎn)生大量的miRNA如miR156,miR159,miR160等,從而反向調(diào)控大量的轉(zhuǎn)錄因子蛋白如WRKY,MYB,NAC等功能蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。最后激活防御信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)通路基因產(chǎn)生抗性來應(yīng)激紋枯病的入侵。另外通過與病原菌蛋白受體結(jié)合,產(chǎn)生一些R基因產(chǎn)物(NBS-LRR,LRR激酶等),從而調(diào)理轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)以及激素的內(nèi)穩(wěn)態(tài),最后激活防御相關(guān)信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)通路基因,產(chǎn)生壓力脅迫響應(yīng)及植物抗病防御反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S435.131.4

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