發(fā)布時間：2017-12-12 04:03

  本文關鍵詞：性類固醇激素對尼羅羅非魚雌雄生長差異與生長相關基因表達的影響

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【摘要】：因為具有生長快、食性雜和適應性強等特點,羅非魚已成為世界重要養(yǎng)殖魚類。其雌雄生長差異明顯,雄性生長快、個體大,而雌性生長慢、個體小;性成熟前雄魚較雌魚生長快,性成熟后更加明顯,部分原因可能性有:性類固醇激素水平、生長與生殖能量配置、攝食消化等差異。本論文以尼羅羅非魚為實驗對象,首先比較了性成熟前雌雄魚生長特征與性類固醇激素分泌水平關系;通過體外注射性類固醇激素,分別研究了性類固醇激素對生長軸相關基因、生肌因子、攝食基因的表達調節(jié)影響;最后比較了雌雄魚性類固醇激素受體表達差異,旨在為羅非魚雌雄性別生長差異的調節(jié)機理研究提供資料,主要結果如下:(1)利用分子標記法、醋酸洋紅壓片法、組織切片技術等方法進行個體性別鑒定,比較了性成熟前期(0.5~4月齡)尼羅羅非魚雌、雄魚生長差異,并檢測了2.5~4.0月齡雌、雄魚血清睪酮(T)、雌二醇(E_2)激素含量。結果發(fā)現(xiàn),雌、雄魚全長、體重分別自3.0月齡、2.5月齡開始出現(xiàn)差異顯著(P0.05)。Logistic擬合全長、體重生長方程為:Lt(♀)=16.443/(1+e~(2.821-1.363*t)),Lt(♂)=18.248/(1+e~(2.752-1.295*t));Wt(♀)=107.704/(1+e~(5.157-1.464*t),Wt(♂)=134.796/(1+e~(5.080-1.417*t),雌、雄魚全長、體重的擬合度均大于0.94,擬合效果均較好。隨著月齡增加,雌、雄魚全長、體重差異逐漸增大,全長生長速度最大時月齡為2.069和2.125,全長生長曲線不具拐點,隨著月齡的增加,逐漸趨向漸進值;體重的拐點月齡為3.523和3.585,拐點體重值為52.352g和67.398g,雄魚體重拐點月齡與拐點體重值均大于雌魚。對Logistic方程求一階導數(shù)和二階導數(shù),分別得雌、雄魚生長速度、生長加速度。雌、雄魚的全長、體重生長速度均是先上升后下降,隨著生長發(fā)育,雌、雄魚體重差異逐漸增大,體重生長速度的差異也逐漸增大。雌、雄魚全長、體重生長加速度變化規(guī)律類似,呈上升-下降-再上升趨勢。在全長生長速度最大時,加速度為零,此后為負值,生長速度減小。體重生長加速度的最大值和最小值(兩個極值)分別對應始速點和終速點,相應分為三個時期:緩慢生長期、快速生長期和漸進生長期,雌魚進入快速生長期的始速點(2.623月齡)和終速點(4.422月齡)都比雄魚(2.655月齡,4.514月齡)提前,雄魚快速增長期的凈增長量(77.831g)和快速增長期持續(xù)時間(1.859月)大于雌魚(1.799g,60.525月),雄魚體重增加顯著大于雌魚。2.5月齡之后,雌、雄魚E_2含量差異顯著(P0.05),3月齡之后,雌、雄魚T含量差異顯著(P0.05),雄魚雄激素水平高、雌激素水平低,生長更快;而雌魚雄激素水平相對低,雌激素水平高,生長較慢,這可能與雌、雄魚在性腺發(fā)育過程中進行的生殖投入不同有關。推測E_2、T含量差異是引起尼羅羅非魚雌雄性別生長差異的原因之一。(2)采用體外注射雌二醇、睪酮的方法結合熒光定量PCR方法,比較了E_2和T對雌雄尼羅羅非魚的生長、攝食、血清性類固醇激素水平、肝臟GH-IGF生長軸基因、肌肉生肌因子基因表達量的影響,結果表明:對照組雄魚較雌魚T水平更高,E_2水平更低。E_2注射后升高血清E_2水平,T注射后升高血清T水平,對照組雌魚較雄魚生長率較低,E_2促進雌魚生長,對雄魚生長影響不明顯,T顯著促進雄魚生長,對雌魚生長影響不明顯;E_2顯著促進雌魚igf1,igf2,ghr1,ghr2表達;但不顯著影響雄魚igf1,igf2,一定程度降低ghr1,ghr2表達T對雄魚作用大于雌魚;顯著升高雄魚igf1,igf2,ghr1,ghr2表達;升高雌魚ghr1,ghr2表達,顯著降低igf2表達。E_2顯著升高雌魚myod1,myf5表達量,T顯著升高雄魚myod1,myod2,myf5表達量,E_2降低雄魚myog2,myf5表達量,不影響myod1表達量,T升高雌魚myog表達量,不顯著影響myod1,myod2表達量。性類固醇激素對GH-IGF生長軸、生肌因子相關基因表達有一定的作用,這種作用表現(xiàn)出明顯的雌雄差異性,推測性雌雄類固醇激素水平不同可能是導致雌雄個體生長差異顯著的一個重要原因。(3)攝食與消化水平是影響魚類生長的重要環(huán)節(jié)。通過體外注射雌二醇(E_2)、睪酮(T),測定注射后6h、12h、24h尼羅羅非魚雌雄魚消化酶(胃蛋白酶、腸淀粉酶、腸脂肪酶)活性,并采用熒光定量PCR方法,比較腦組織ghrelin、leptin、orexin、NPY、CCK mRNA表達量的差異。結果表明,注射后24h,T顯著提高雄魚淀粉酶活性(P0.05);注射E_2和T后12h,對照組三種消化酶活性均升高,且此時對照組雄魚淀粉酶、脂肪酶活性較雌魚高(P0.05)。注射后6h、12h、24h,E_2顯著升高雌魚ghrelin、NPY mRNA表達量(P0.05),但不顯著影響雄魚,E_2降低雌魚leptin mRNA表達量,6h時E_2升高雄魚leptin mRNA表達量(P0.05),12h、24h影響不明顯;注射T顯著升高雄魚ghrelin、NPY mRNA表達量(P0.05),但不顯著影響雌魚,降低雄魚leptin mRNA表達量,6h、24h時T顯著升高雌魚leptin mRNA表達量,12h時影響不明顯;24h時E_2顯著升高雌魚orexin表達量(P0.05),其他時間點影響不顯著,24h時T顯著升高雄魚orexin表達量(P0.05),其他時間點影響不顯著;6h、12h、24h時E_2顯著降低雌魚CCK mRNA表達量,T顯著降低雄魚表達量。結果表明,E_2顯著升高雌魚、T顯著升高雄魚促攝食基因表達量降低抑制食欲基因表達量,對雌雄魚脂肪酶、蛋白酶影響不明顯,攝食基因可能參與了性類固醇激素對雌雄尼羅羅非魚生長的調節(jié)。(4)采用Western-blot、免疫組化、熒光定量PCR的方法,對尼羅羅非魚雌雄魚肝臟、性腺、腸、腎臟進行雌雄激素受體(ER、AR)基因、蛋白質表達水平進行了比較,Western-blot表明:性腺(精巢、卵巢)ER蛋白表達量最高,腸、腎臟中差異不明顯,雌雄魚肝臟中ER蛋白表達量差異明顯(P0.05),卵巢和精巢ER蛋白表達量差異明顯(P0.05);卵巢和精巢AR蛋白表達量差異明顯,雌雄魚腎臟AR蛋白表達量差異明顯,性腺(精巢、卵巢)AR蛋白表達量最高。免疫組化結果表明:雌雄魚性腺、腸、腎中均檢測到了ER和AR免疫陽性反應,雌魚肝臟陽性細胞主要分布在中央靜脈附近,雌魚肝臟未發(fā)現(xiàn)AR陽性反應,雄魚肝臟未發(fā)現(xiàn)ER陽性反應;雄魚腸免疫陽性細胞主要分布在腸絨毛和腸粘膜下層;雌魚腎ER較雄魚陽性反應增強,雄魚腎AR較雌魚陽性反應增強,免疫陽性反應主要分布在腎小管中;卵巢ER陽性細胞分布在濾泡膜周圍,且其ER陽性反應較雄魚明顯,精巢AR陽性細胞分布在精小管周圍,且其AR陽性反應較雌魚明顯。熒光定量PCR結果表明:在四種組織中均可檢測到ER mRNA表達,AR也可在四種組織中監(jiān)測到,并且在性腺中表達量最高,雄魚腸道、腎臟表達量高于肝臟。相同組織中,雌魚卵巢、肝臟ER mRNA顯著高于雄魚(P0.05);雄魚精巢、腸組織AR mRNA表達量顯著高于雌魚(P0.05)。推測肝臟處于性類固醇激素對雌雄生長調節(jié)的關鍵位置,雌雄魚性腺ER差異明顯,且雌雄魚AR差異明顯,性類固醇激素受體參與性腺發(fā)育,且對雌雄生長同時有調節(jié)作用。
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4

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本文編號：1281066