發(fā)布時(shí)間：2018-04-11 12:14

  本文選題：豬瘟病毒 + 感染性克隆�。� 參考：《浙江大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：豬瘟是豬的重要傳染病,具有致死性及高度傳染性等特點(diǎn),其病原為豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV),為黃病毒科瘟病毒屬成員,是有囊膜的單股正鏈RNA病毒。CSFV基因組長(zhǎng)約12.3kb,基因組兩端為非編碼區(qū),編碼區(qū)為一個(gè)11697bp的開(kāi)放性閱讀框,編碼長(zhǎng)度為3898個(gè)氨基酸的多聚前體蛋白,在宿主細(xì)胞蛋白酶的作用下逐步裂解為8種非結(jié)構(gòu)蛋白和4種結(jié)構(gòu)蛋白,基因組內(nèi)的順序依次為Npro、Core、Erns、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、 NS5A和NS5B,其中Core、Erns、E1和E2為結(jié)構(gòu)蛋白。對(duì)CSFV主要蛋白的功能研究已較為深入,在病毒復(fù)制及其與宿主細(xì)胞互作研究方面也取得了進(jìn)展,這些研究成果得益于感染性克隆技術(shù)發(fā)展。以疫苗C株作為骨架進(jìn)行新型豬瘟標(biāo)記疫苗的開(kāi)發(fā)是一大研究熱點(diǎn),但相對(duì)于強(qiáng)毒株,C株病毒本身在體外培養(yǎng)細(xì)胞中的生長(zhǎng)較慢。我們發(fā)現(xiàn)以C株感染性克隆為基礎(chǔ)拯救的重組病毒滴度較低,可能與其細(xì)胞適應(yīng)性差有關(guān)。本研究擬在C株和強(qiáng)毒株石門株感染性克隆的基礎(chǔ)上,通過(guò)對(duì)兩個(gè)毒株不同蛋白區(qū)段進(jìn)行相互置換,構(gòu)建一系列重組嵌合病毒,以研究結(jié)構(gòu)蛋白及非結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)豬瘟病毒細(xì)胞適應(yīng)性的影響,解析影響豬瘟病毒在ST細(xì)胞和PK-15細(xì)胞中復(fù)制的重要蛋白,為從基因水平上對(duì)疫苗C株進(jìn)行改造提供依據(jù),也為進(jìn)一步探索豬瘟病毒體外復(fù)制和組裝機(jī)制奠定基礎(chǔ)。1.重組c株商低代次毒株與石門株體外增殖能力差異比較在相同感染比條件下,無(wú)論是高代次還是低代次重組C株病毒(RecCpp40和RecCpp80)在細(xì)胞內(nèi)的增殖能力均弱于石門株,但三株病毒感染過(guò)程中基因組復(fù)制水平差異不明顯(P0.05)。感染后96h RecCpp80的子代病毒數(shù)量是RecCpp40的30倍以上(P0.01)；感染后96h細(xì)胞外病毒粒子數(shù)比較結(jié)果顯示,胞內(nèi)病毒增殖能力與釋放到胞外的病毒量成正比,石門株胞內(nèi)增殖能力強(qiáng),釋放到胞外的病毒粒子數(shù)也顯著高于重組C株病毒(P0.05);石門毒株C株細(xì)胞間的擴(kuò)散能力顯著優(yōu)于RecCpp80,特別是在覆蓋瓊脂糖的情況下,石門毒株的擴(kuò)散能力受瓊脂培養(yǎng)基的影響較小,在兩種培養(yǎng)條件下均能形成大而彌散的病毒斑。因此,我們推測(cè)C株與石門株之間的細(xì)胞適應(yīng)性差異主要與病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖能力及其細(xì)胞間擴(kuò)散能力相關(guān)。2.豬瘟病毒C株與石門株嵌合病毒構(gòu)建及其細(xì)胞內(nèi)增殖能力和兔體反應(yīng)比較為了解析不同毒株體外增殖能力差異的分子基礎(chǔ),我們構(gòu)建了石門株的感染性克隆,并以疫苗C株和石門株感染性克隆為基礎(chǔ)構(gòu)建了豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因互換的感染性克隆,并成功拯救了石門株重組病毒和11個(gè)重組嵌合豬瘟病毒。體外生長(zhǎng)特性比較結(jié)果顯示,疫苗C株和石門株半長(zhǎng)基因組的相互置換可提高C株病毒的體外增殖能力,其中置換有石門株非結(jié)構(gòu)蛋白至非編碼區(qū)半長(zhǎng)的嵌合毒株與C株重組病毒RecCpp80相似。置換石門毒株NS2-NS4B的重組嵌合C株病毒體外增殖能力顯著提高,而置換有C株NS2-NS4B區(qū)段嵌合石門毒株的體外增殖能力低于親本石門重組病毒,說(shuō)明非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-NS4B區(qū)段對(duì)豬瘟病毒的體外增殖具有重要作用。置換石門毒株NS4A-3 -UTR片段或NS5A-3 -UTR,不增強(qiáng)C株嵌合病毒的體外增殖能力。為了評(píng)價(jià)基因置換對(duì)疫苗C株兔體適應(yīng)性的影響,將嵌合毒株進(jìn)行了兔體接種實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,分別含有C株前半長(zhǎng)(結(jié)構(gòu)蛋白)或后半長(zhǎng)(非結(jié)構(gòu)蛋白)基因的嵌合毒株均能夠引起兔定型熱反應(yīng),含有石門毒株NS2-NS4B基因區(qū)段的嵌合C株病毒亦能引起兔體溫升高反應(yīng),但置換C株NS4A-3-UTR和NS2-NS4B區(qū)段的嵌合石門毒株則不誘導(dǎo)兔體發(fā)熱反應(yīng)。以上結(jié)果說(shuō)明C株的兩端非編碼區(qū)以及結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域與兔體適應(yīng)性密切相關(guān)。3.豬瘟病毒NS2跨膜區(qū)在病毒增殖中的作用為了初步解析NS2蛋白在豬瘟病毒增殖中的作用,對(duì)NS2的N端6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)(Transmembrane, TM)序列分別進(jìn)行了PCR擴(kuò)增后,構(gòu)建了12個(gè)含有NS2不同區(qū)段融合表達(dá)GFP的真核表達(dá)重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞后比較了不同跨膜區(qū)融合蛋白的亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明,NS2蛋白N端不同區(qū)段的跨膜結(jié)構(gòu)均能在定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)網(wǎng)狀分布。以石門株感染性克隆為模板,對(duì)NS2的N端6段潛在跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行單段缺失,或通過(guò)在跨膜區(qū)核心序列中央插入丙氨酸改變跨膜區(qū)構(gòu)象,成功構(gòu)建12個(gè)NS2不同突變的感染性克隆,體外轉(zhuǎn)錄RNA電轉(zhuǎn)ST細(xì)胞以拯救重組病毒。結(jié)果顯示,缺失任何一段NS2跨膜結(jié)構(gòu)均導(dǎo)致病毒復(fù)制缺陷,不能產(chǎn)生子代病毒。在TMl正中插入丙氨酸后不影響子代病毒復(fù)制和組裝,在TM3和TM6中相應(yīng)的插入則導(dǎo)致病毒產(chǎn)生時(shí)間延后,在3-4代連續(xù)傳代才能獲得重組病毒；而在TM2,4,5中分別插入突變后,病毒RNA在細(xì)胞內(nèi)呈低水平復(fù)制,且不產(chǎn)生重組病毒。上述結(jié)果說(shuō)明NS2的跨膜區(qū)在豬瘟病毒復(fù)制和組裝過(guò)程中具有重要作用,但作用的具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。綜上所述,我們以豬瘟病毒C株與石門株之間在體外培養(yǎng)細(xì)胞適應(yīng)性差異為切入點(diǎn),通過(guò)結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白基因置換以及NS2蛋白跨膜區(qū)的缺失或丙氨酸插入,探明了非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-NS4B區(qū)以及NS2跨膜區(qū)對(duì)豬瘟病毒的增殖具有重要作用,疫苗C株基因組兩端的非編碼區(qū)以及結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域介導(dǎo)兔體發(fā)熱反應(yīng)。研究結(jié)果為深入探索豬瘟病毒的增殖機(jī)制和豬瘟疫苗C株的改良奠定了良好基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S855.3

【參考文獻(xiàn)】

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6 許振輝,應(yīng)松成,沈超,屈三甫,鄭從義,王在時(shí);豬瘟病毒野毒株持續(xù)感染細(xì)胞模型的穩(wěn)定性研究[J];中國(guó)病毒學(xué);2003年03期

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本文編號(hào)：1735984