發(fā)布時(shí)間：2018-05-02 14:00

  本文選題：家蠅 + 抗菌肽��； 參考：《吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：近年來,隨著抗生素在疾病防治、衛(wèi)生保健品及動(dòng)物飼料等方面的不規(guī)范使用,導(dǎo)致一些抗藥的超級(jí)細(xì)菌、病毒不斷涌現(xiàn),抗生素的使用效果逐年下降,給疾病防治帶來了極大困難。因此,尋找新型、安全、高效的抗菌制劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)的抗生素,已成為當(dāng)前甚至未來幾十年國內(nèi)外抗菌藥物研究的熱點(diǎn)�？咕�肽是生物體內(nèi)產(chǎn)生的一類具有較強(qiáng)抗細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲、支原體、慢病毒乃至腫瘤細(xì)胞活性的小分子多肽,以具有較低免疫原性、抗菌譜廣、毒副作用小和不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性而著稱,備受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。家蠅幼蟲體內(nèi)外常攜帶多種病原菌,并能向人、家畜和家禽傳播多種疾病,而本身卻很少發(fā)病,即使在高密度、大規(guī)模的人工養(yǎng)殖條件下,也極少出現(xiàn)集體發(fā)病的現(xiàn)象,其獨(dú)特的抗病能力與其體內(nèi)產(chǎn)生的多種抗菌肽有關(guān)。家蠅抗菌肽種類多、抗菌譜廣、抗菌作用獨(dú)特,具有傳統(tǒng)抗菌藥物無可比擬的優(yōu)點(diǎn),因此,家蠅抗菌肽有可能成為新一代的抗菌制劑,在一定程度上部分代替抗生素,并有效遏制細(xì)菌耐藥性的蔓延。本研究在以雞源沙門氏菌誘導(dǎo)家蠅幼蟲構(gòu)建的抑制性消減文庫(SSH)的基礎(chǔ)上,采用RACE技術(shù)獲得了一條大小為198bp的抗菌肽基因,命名為MDAP-2,并對(duì)該基因進(jìn)行了克隆和生物學(xué)功能預(yù)測(cè),結(jié)果顯示其結(jié)構(gòu)獨(dú)特,與Genbank中收錄的所有基因的核苷酸序列均無同源性,推斷其可能是一個(gè)新的基因,基因序列已上傳Genbank,登錄號(hào)為KJ787648。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示:MDAP-2的分子量為7.785Kda;理論等電點(diǎn)為10.61;親水性較強(qiáng),最大值達(dá)2.811;二級(jí)結(jié)構(gòu)以α 螺旋為主。為了進(jìn)一步確定MDAP-2的主要生物學(xué)功能,本研究將該基因與載體pET-32a(+)連接構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒,并在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行了表達(dá),然后采用鎳親和層析柱對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了純化,并對(duì)純化產(chǎn)物的抗菌活性進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)MDAP-2對(duì)臨床分離的部分G-菌(豬源大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌耐藥株、牛巴氏桿菌)有抑制作用,對(duì)雞源沙門氏菌的抑菌環(huán)直徑可達(dá)25mm,但對(duì)受檢的G+菌無抑制作用,該特性與以往發(fā)現(xiàn)的抗菌肽有所不同,結(jié)合其核苷酸/氨基酸序列的獨(dú)特性,推測(cè)其可能是一個(gè)新的家蠅抗菌肽,并存在特殊的生物學(xué)活性和殺菌機(jī)制。為了研究MDAP-2的生物學(xué)活性,本研究采用圓二光譜技術(shù)對(duì)其在溶液中的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,并檢測(cè)了其對(duì)家兔紅細(xì)胞的溶血性、在Babl/c小鼠體內(nèi)的生物安全性進(jìn)行檢測(cè)。二級(jí)結(jié)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果顯示,抗菌肽MDAP-2在5mM PBS溶液中(模擬水環(huán)境)和含有50%TFE及30mM SDS的PBS溶液中(模擬細(xì)胞膜結(jié)構(gòu))均在190nm和200nm處有很強(qiáng)的正吸收峰,在208nm、222nm處有很強(qiáng)的負(fù)吸收峰,表明MDAP-2二級(jí)結(jié)構(gòu)中以α-螺旋為主,并存在少量β 折疊結(jié)構(gòu),與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果基本吻合。體外溶血活性檢測(cè)結(jié)果顯示,當(dāng)抗菌肽MDAP-2濃度達(dá)到1600μg/ml時(shí),溶血率僅為6.6%,低于文獻(xiàn)報(bào)道中的豬乳鐵蛋白肽LFP-20(256μg/ml)和八肽菌素(320μg/ml),由此可見MDAP-2具有較低的體外溶血活性,對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞毒性很低。采用小鼠尾靜脈單次給藥的方法檢測(cè)了抗菌肽MDAP-2對(duì)小鼠的急性毒性,LD50為37.564 mg/kg,95%的可信限為34.537和42.813mg/kg,其毒性低于報(bào)道中的多種抗菌肽,表明抗菌肽MDAP-2對(duì)小鼠具有較低的毒性。為了研究MDAP-2的抗菌機(jī)制,本研究采用熒光探針技術(shù)、透射電子顯微鏡技術(shù)及流式細(xì)胞術(shù)等試驗(yàn)方法研究了抗菌肽MDAP-2對(duì)雞沙門菌生長曲線的影響,對(duì)細(xì)菌微觀結(jié)構(gòu)的影響,對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性、完整性的影響,對(duì)細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜的去極化能力及其DNA結(jié)合能力進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明,MDAP-2對(duì)雞沙門氏菌的生長具有明顯的抑制作用,在MDAP-2濃度為0.24mM時(shí)即能殺滅細(xì)菌;透射電鏡圖片顯示,MDAP-2能使雞沙門氏菌的細(xì)胞膜嚴(yán)重變形、破損,內(nèi)容物外泄,導(dǎo)致細(xì)菌死亡;β-半乳糖苷酶檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果顯示,MDAP-2能夠使細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性增加,把β-半乳糖苷酶釋放到細(xì)胞外,分解ONPG,使得反應(yīng)體系中A405nm的OD值升高;采用DiBAC4(3)膜電位敏感性探針對(duì)抗菌肽作用過的雞沙門菌細(xì)胞進(jìn)行染色,于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)其熒光強(qiáng)度變化,其熒光強(qiáng)度明顯增加,可達(dá)35.9%,可見MDAP-2可使細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜去極化,導(dǎo)致細(xì)菌膜內(nèi)外電勢(shì)差增加,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌死亡;采用PI對(duì)抗菌肽MDAP-2作用過的雞沙門菌細(xì)胞進(jìn)行染色,于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)其熒光強(qiáng)度變化,結(jié)果顯示抗菌肽處理組的細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度明顯增加,可達(dá)66.5%。說明抗菌肽MDAP-2能破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性,使細(xì)胞內(nèi)離子外流,水分子內(nèi)流,導(dǎo)致細(xì)菌死亡;MDAP-2能夠抑制質(zhì)粒DNA的電泳遷移率,使電泳速度變慢,證明抗菌肽MDAP-2具有DNA結(jié)合能力,可能通過進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi),阻礙DNA復(fù)制來發(fā)揮抗菌作用。
[Abstract]:In recent years , with the use of antibiotics in the prevention and control of diseases , health care products and animal feed , it is very difficult to find novel , safe and efficient antibiotic preparation . 浜叉按鎬ц緝寮，

本文編號(hào)：1834201