CaMKⅡδ及bcl-2、bax在新西蘭大白兔心肌肥厚模型中的作用研究
【摘要】 目的：探討新西蘭大白兔心肌肥厚時CaMK Ⅱδ和凋亡基因bcl-2、bax在其心肌組織中的表達規(guī)律及相互關(guān)系,明確CaMK Ⅱδ及凋亡基因bcl-2、bax在肥厚心肌中的作用,進一步明確心肌細胞凋亡的調(diào)控機制,為臨床研發(fā)防止心肌肥厚、減少心肌細胞凋亡及心力衰竭發(fā)生的新藥提供新思路和方向。方法：1、40只新西蘭大白兔按隨機原則分為實驗組及對照組,每組各20只,雌雄不限,實驗組新西蘭大白兔采用腹主動脈縮窄術(shù)進行心肌肥厚造模,對照組新西蘭大白兔僅行開腹手術(shù),不縮窄腹主動脈即關(guān)閉腹腔。術(shù)后8周分別對實驗組和對照組進行超聲心動圖檢查,確定實驗組造模成功后,分別處死實驗組及對照組新西蘭大白兔,并留取心臟標本進行檢測。2、采用熒光定量PCR檢測實驗組及對照組新西蘭大白兔心肌組織中CaMKHⅡδ、bcl-2及bax的表達量。3、統(tǒng)計學(xué)分析,比較實驗組和對照組心肌組織中CaMK Ⅱδ和bcl-2、bax表達量的變化關(guān)系,以及CaMK Ⅱδ和bcl-2/bax表達情況的相關(guān)性分析。結(jié)果：1、實驗組新西蘭大白兔術(shù)后8周均出現(xiàn)室間隔(IVS)和左室后壁(LVPW)的明顯增厚(P<0.05),為明顯心肌肥厚的表現(xiàn),而射血分數(shù)(EF)及舒張末(LVDd)、收縮末(LVDs)未見明顯差異(P>0.05),表明術(shù)后8周實驗組新西蘭大白兔均出現(xiàn)明顯的心肌肥厚表現(xiàn),而對照組相應(yīng)指標未見明顯改變；2、與對照組相比,實驗組新西蘭大白兔心肌組織中CaMKⅡδ的表達明顯增加(P<0.01)：3、與對照組相比,實驗組新西蘭大白兔心肌組織中bcl-2表達減少而bax表達增加,差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),bcl-2/bax比值明顯減小(P<0.05)；4、實驗組新西蘭大白兔心肌組織中CaMK Ⅱδ表達量增加與bcl-2/bax比值減小呈明顯相關(guān)性,而對照組未見有明顯的相關(guān)性。結(jié)論：1、通過腹主動脈縮窄術(shù)建立心肌肥厚模型的方法是可性并有效的,超聲心動圖檢查可較好地反映心肌肥厚的程度,主要表現(xiàn)在LVPW及IVS增厚,說明實驗組新西蘭大白兔在腹主動脈縮窄術(shù)后8周均出現(xiàn)左室肥厚,對照組無明顯變化,表明8周的造模時間已經(jīng)足夠讓其明顯出現(xiàn)左室肥厚；實驗組及對照組EF均未見有明顯變化,表明心力哀竭的發(fā)展需要更長的時間；2、CaMK Ⅱδ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是心肌肥厚形成重要環(huán)節(jié)之一,同時心肌肥厚時伴有明顯的心肌細胞凋亡,二者呈明顯相關(guān)性,表明CaMK Ⅱδ表達增加可能通過降低bcl-2/bax而誘導(dǎo)心肌細胞凋亡,共同導(dǎo)致心肌肥厚。
引言
一直以來，心腦血管疾病是發(fā)達國度的重要去世亡緣故原由，比年來我國的抱病率明顯上升，嚴峻影響中老年人的康健。病理性心肌肥厚(Pathological myocardial hypertrophy)是心臟對壓力、容量超負荷等應(yīng)激的一種順應(yīng)性反響，是浩繁心血管疾病的配合病理歷程，常見于高血壓、冠心病、心肌梗去世、心瓣膜病、天本性心臟病等多種心血管疾病。病理性心肌肥厚是心血管疾病的獨立傷害因子，它可以明顯增長室性心律變態(tài)、心力弱竭乃至心源性猝去世等心血管不測變亂的產(chǎn)生11]，因此研究心肌肥厚的產(chǎn)生生長，賜與以早期干涉處置處罰、逆轉(zhuǎn)肥厚，具有重要的意義。
現(xiàn)在臨床患者固然顛末恒久服用降壓藥等血壓得到較好的控制，但心肌肥厚的產(chǎn)生仍得不到有用緩解，現(xiàn)在治療心肌肥厚的藥物重要有：1、血管告急素轉(zhuǎn)換酶克制劑（ACEIs)，如依那普利等；2、血管告急素II受體阻斷劑(ARBs)，如氯沙坦等；f丐離子拮抗劑，有報道表現(xiàn)《丐離子拮抗劑是反抗心肌肥厚最好的藥物，明顯優(yōu)于ACEIs,常用的銷苯地同等；3、別的的如利尿劑等，一樣通常不但獨利用，多與別的抗心肌肥厚藥物團結(jié)用藥。臨床抗心肌肥厚治療已經(jīng)被證明不但能進步左室貫注及冠狀動脈儲備，還能淘汰心律變態(tài)、猝去世等的產(chǎn)生，進步心血管疾病的預(yù)后結(jié)果。但現(xiàn)在臨床抗心肌肥厚藥物其機制研究仍未非常明白。
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第一部分文獻硏究
一、心肌肥厚的分子機制硏究進展
心肌肥厚（Myocardial hypertrophy)是心臟對各種刺激所產(chǎn)生的適應(yīng)性增生，其表現(xiàn)為心肌細胞體積的增大，非心肌細胞（如成纖維細胞、膠原等）的生成與增殖，同時伴有心室結(jié)構(gòu)和功能的改變。心肌肥厚時，心肌細胞的蛋白合成增加、體積增大、直徑增長，心肌肌節(jié)數(shù)量增多，纖維組織增生，而心肌細胞的數(shù)量卻沒有增加，常伴有胚胎基因再表達。其主要的病理變化包括心肌細胞肥大、心肌間質(zhì)增生以及心肌細胞外基質(zhì)重建等。心肌肥厚的發(fā)病機制與壓力負荷增加、神經(jīng)內(nèi)分泌因素、鈣離子超載、原癌基因等密切相關(guān)'5—7]。
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二、 Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶n (CaMKII)與'心肌肥厚的研究進展
細胞內(nèi)Ca2+在多種不同的細胞功能中均起著重要的作用。許多研究表明[16-181：細胞內(nèi)Ca2+信號的改變是心肌肥厚反應(yīng)的首要刺激，在心肌肥厚和基因表達中發(fā)揮主要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+可經(jīng)多條信號途徑誘導(dǎo)心肌肥厚的形成：
(1)Ca2+通過結(jié)合調(diào)蛋白(CaM)激活Ca2+-CaM依賴性的蛋白激酶(CaMK)，誘導(dǎo)心肌增強因子(MEF2)表達增多參與心肌肥厚；
(2)Ca2+激活鈣調(diào)憐酸酶(calcineurin, CaN),激活的《丐調(diào)憐酸酶可以刺激胞衆(zhòng)活化T細胞核因子去憐酸化，使之進入核內(nèi)與GATA4轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，促進心肌肥厚的發(fā)生；
(3)Ca2+-二�；视�-蛋白激酶C-絲裂素活化蛋白激酶通路；
(4)Ca2+-肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)途徑；
(5)Ca2+直接入核與鈣結(jié)合蛋白結(jié)合等多種信號通道介導(dǎo)心肌肥厚。
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第二部分 實驗研究 .........................19-27
一、動物模型 ........................19-20
(一) 材料 .........................19
(二) 模型制備 .......................19-20
(三) 超聲心動圖檢查 ...............20
二、實驗方法 .........................20-24
(一) 引物設(shè)計 .................21
(二) 組織細胞總RNA制備(異硫氰酸胍GCT法) ............21-22
(三) 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) ..............22-23
(四) 熒光定量(SYBR Green Ⅰ Assay) .............23-24
(五) 統(tǒng)計分析 .............24
三、研究結(jié)果 ..............24-27
(一) 動物模型變化................ 24-25
(二) 心臟重量變化 .................25
(三) 熒光定量PCR結(jié)果變化.............. 25-27
第三部分 分析與討論
近年來研究表明'53^{病因素通過肥大信號刺激引起細胞反應(yīng)改變的信號傳導(dǎo)途徑是心肌肥厚發(fā)病的關(guān)鍵。心肌肥厚時存在Ca2+信號紊亂和基因表達異常，細胞內(nèi)Ca2+濃度升高是心肌肥厚信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。而心臟作為泵的主要功能很大程度上取決于心肌細胞，研究表明心肌肥厚時伴有明顯的心肌細胞凋亡的發(fā)生，但其發(fā)生機制仍未十分明確。
本研究通過腹主動脈縮窄術(shù)建立新西蘭大白兔心肌肥厚的動物模型，研究Ca2+依賴的蛋白激酶和凋亡基因的表達規(guī)律及關(guān)系，探討Ca2+信號與細胞凋亡在心肌肥厚發(fā)生過程中的病理生理意義，以進一步闡明心肌肥厚形成的機制。
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結(jié)語
隨著生活方式的改變，心血管疾病目^是世界h發(fā)病率和致死率很A-的疾病之--，最新研究已證明心肌肥厚是心血管疾病的獨立危險因子，它"UA^ifl加心源性猝死、慢性心力衰竭和室性心律失常等心血管意外事件的發(fā)生率和死0卞，故研究心肌肥厚發(fā)生發(fā)展，予以早期干預(yù)、逆轉(zhuǎn)肥厚，具有重要的意義。
本研究通過腹主動脈縮窄術(shù)建立新西蘭大白兔心肌肥厚模型，探i、t肥的心肌組織中CaMK ]15和凋亡基因bcl-2、 bax /H心肌組織的表達規(guī)忭，明確CaMK II 5對心肌細胞凋亡的調(diào)控機制，為臨床研發(fā)減少心肌細胞凋1::,防止心肌肥I1/發(fā)生的新藥提供新思路。
研究證明CaMKll的過度表達4心肌細胞凋1:：均參4了心肌肥^的發(fā)屮機制，M新研究也表明CaMKll通過對相關(guān)凋亡^W進行調(diào)節(jié)，從而引起心肌細胞凋廣，參與心肌肥厚的發(fā)生，心肌細胞是代償性心肌肥厚發(fā)展為心力衰竭的--個Tt^H-折點，這將為臨床丌發(fā)具有特異性抑制細胞凋1'：的新藥研究及使用時間提供依抝；和方向。如我們可以設(shè)計多種途徑來抑制CaMKll的藥物，如抑制CaMKII催化區(qū)ATP結(jié)合、維持CaMK II抑制性構(gòu)象、阻止CaMK II與靶蛋A相結(jié)合、阻止CaM結(jié)合到caMK ]1和附止CaMK 11非Ca2+依賴性活化的藥物(如氧化應(yīng)激)。隨若對CaMK 11 {,j ''}H' 3途徑的深入研究，CaMK II可望成為未來心肌肥厚和心袞治療的新靶點。
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本文編號：9209
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