發(fā)布時間：2016-11-27 19:32

  本文關(guān)鍵詞：黃芪甲苷對實驗性糖尿病血管病變的保護作用及機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《安徽醫(yī)科大學(xué)》 2015年

黃芪甲苷對實驗性糖尿病血管病變的保護作用及機制研究

馬玉紅  

【摘要】：第一部分黃芪甲苷對糖尿病大鼠主動脈病變的影響目的:觀察黃芪甲苷(astragalosideⅣ,ASTⅣ)對糖尿病(diabetes mellitus,DM)模型大鼠血管病變的保護作用,分析其可能的作用機制。方法:采用高糖高脂飲食4 w聯(lián)合一次性腹腔注射(intraperitoneal injection,ip)鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)35 mg/kg復(fù)制大鼠DM模型。選擇造模成功(血糖16.7 mmol/L)的大鼠隨機分組為:模型組(Model,等容量羧甲基纖維素鈉,ig)、ASTⅣ低、中、高劑量組(20、40、80 mg/kg/d,ig)、胰島素(insulin,Ins)組(0.15 U/kg/d,ih),另設(shè)正常對照組(Control,等容量羧甲基纖維素鈉,ig),連續(xù)給藥12 w。實驗過程中觀察各組大鼠一般狀況(精神、飲食飲水、大小便等)以及測量各組大鼠體重、血糖(blood glucose,BG)的變化;并于末次給藥結(jié)束后取血,采用生化法檢測紅細胞糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin,GHb)含量、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)、膽固醇(cholesterol,CHOL)、甘油三酯(triglyceride,TG)和高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)含量;比色法檢測血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;生化法檢測血漿部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time,APTT)和凝血酶原時間(prothrombin time,PT);放射免疫法檢測空腹血清胰島素(fasting insulin,FISN)水平;酶聯(lián)吸附免疫法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測晚期糖基化產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)水平;HE染色法觀察各組大鼠主動脈病理組織形態(tài)學(xué)變化;透射電子顯微鏡(electron microscope,EM)觀察主動脈內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)病變情況;免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry,IHC)觀察主動脈內(nèi)皮細胞TGF-β1陽性細胞表達情況;定量PCR(quantitative polymerase chain reaction,QPCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot,WB)法分別檢測主動脈Nox4、TGF-β1、Smad2、BCL-2、BAX、Caspase 3的m RNA和蛋白表達水平。結(jié)果:(1)與正常組相比,模型組DM大鼠精神萎靡,倦臥少動,多飲多食多尿,毛發(fā)脫落,體重降低(P0.01),主動脈臟器指數(shù)增加(P0.05)。與模型組相比,ASTⅣ(40、80 mg/kg)和Ins組精神好轉(zhuǎn),活動增多,三多一少癥狀減輕,毛發(fā)脫落較少,體重增加在第12 w、16 w有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05,P0.01)。(2)模型組DM大鼠造模后BG顯著升高,血清LDL、CHOL和TG含量顯著增高,HDL含量顯著降低,紅細胞GHb含量明顯增加,血清FISN水平明顯增加(P0.01)。與模型組比較,ASTⅣ(40、80 mg/kg)組在12 w、16 w血糖下降(P0.05,P0.01),而Ins組在給藥后出現(xiàn)明顯降血糖作用(P0.01)。ASTⅣ(40、80 mg/kg)和Ins組能顯著降低血清LDL、CHOL和TG含量,升高HDL含量,降低紅細胞GHb含量,降低血清FISN水平(P0.05,P0.01)。(3)模型組DM大鼠血清AGEs水平顯著增多,血漿PT和APTT顯著縮短(P0.01)。ASTⅣ(40、80 mg/kg)和Ins組可降低血清AGEs水平,延長PT和APTT(P0.05,P0.01)。(4)HE染色結(jié)果顯示模型組DM大鼠主動脈內(nèi)皮細胞層及內(nèi)膜和外膜均未見明顯改變,僅中層平滑肌排列稍紊亂;但透射電鏡結(jié)果顯示模型組DM大鼠主動脈內(nèi)皮細胞與平滑肌細胞層分離、胞膜皺縮、胞體內(nèi)部分線粒體空泡變性、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張、核固縮,提示主動脈內(nèi)皮細胞已出現(xiàn)明顯的超微結(jié)構(gòu)損傷。ASTⅣ各劑量組和Ins組可減輕主動脈內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)損傷。(5)模型組DM大鼠血清SOD活力顯著降低,MDA含量明顯增高,主動脈Nox4m RNA和蛋白表達顯著增高(P0.01)。ASTⅣ各劑量組和Ins組可顯著升高血清SOD活力,降低MDA含量,下調(diào)主動脈Nox4 m RNA和蛋白表達(P0.05,P0.01)。(6)模型組DM大鼠主動脈TGF-β1和Smad2 m RNA和蛋白表達顯著增高(P0.01);IHC結(jié)果顯示模型組DM大鼠主動脈內(nèi)皮細胞中TGF-β1陽性細胞顯著增多(P0.01)。ASTⅣ(40、80 mg/kg)和Ins組可明顯下調(diào)DM大鼠主動脈TGF-β1和Smad2 m RNA和蛋白表達,減少主動脈內(nèi)皮TGF-β1陽性表達細胞數(shù)量(P0.05,P0.01)。(7)模型組DM大鼠主動脈BAX和Caspase 3 m RNA和蛋白表達顯著增高,BCL-2m RNA和蛋白表達顯著降低(P0.01);ASTⅣ(40、80 mg/kg)和Ins組可明顯下調(diào)DM大鼠主動脈BAX和Caspase 3 m RNA和蛋白表達,上調(diào)BCL-2 m RNA和蛋白表達水平(P0.05,P0.01)。結(jié)論:(1)高糖高脂飲食4 w聯(lián)合STZ 35 mg/kg ip成功復(fù)制大鼠DM模型。(2)ASTⅣ對DM大鼠主動脈損傷具有保護作用。(3)ASTⅣ保護作用機制可能與調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂,減少氧化應(yīng)激損傷,抑制TGF-β1/Smad2表達,調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因BCL-2、BAX和Caspase 3表達有關(guān)。第二部分黃芪甲苷對H2O2誘導(dǎo)HUVECs凋亡的影響目的:觀察ASTⅣ對過氧化氫(hydrogenperoxide,H2O2)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)損傷的保護作用,以及對Nox4/ROS/TGF-β1/Smad2表達的影響。分析ASTⅣ保護作用的可能機制。方法:體外實驗采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]法檢測ASTⅣ的半數(shù)有效濃度(effective concentration 50,EC50);Annexin-V/PI雙染后用流式細胞術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測細胞凋亡率;采用FCM檢測細胞內(nèi)反應(yīng)氧產(chǎn)物(reactive oxygen species,ROS)含量;QPCR和WB法分別檢測各組Nox4、TGF-β1、Smad2、BCL-2、BAX和Caspase 3的m RNA和蛋白表達水平。結(jié)果:(1)H2O2可增加HUVECs凋亡率,上調(diào)Nox4表達,升高ROS水平,上調(diào)TGF-β1、Smad2、BAX和Caspase 3的表達,下調(diào)BCL-2表達。(2)ASTⅣ(100μmol/L)可降低細胞凋亡率,顯著下調(diào)Nox4表達,降低ROS水平,下調(diào)TGF-β1、Smad2、BAX和Caspase 3表達,上調(diào)BCL-2表達。(3)二苯碘(Diphenyliodonium,DPI)抑制Nox4表達,降低細胞凋亡率,降低ROS水平,下調(diào)TGF-β1/Smad2表達,調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因表達。(4)LY2109761抑制TGF-β1/Smad2表達,減少細胞凋亡率,調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達,但是對Nox4的表達及ROS的水平無顯著影響。結(jié)論:(1)H2O2可通過上調(diào)Nox4表達,減少ROS生成,上調(diào)TGF-β1/Smad2表達,導(dǎo)致HUVECs細胞凋亡。(3)ASTⅣ對H2O2誘導(dǎo)HUVECs損傷具有保護作用,其具體機制可能與下調(diào)Nox4表達,抑制ROS生成,下調(diào)TGF-β1/Smad2表達,調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R285.5
【目錄】：

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本文編號：196175