發(fā)布時(shí)間：2017-12-23 15:51

  本文關(guān)鍵詞：溶藻弧菌Qrr1-5的分子克隆及其生理功能的鑒定　出處：《陜西科技大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是一種革蘭氏陰性海洋細(xì)菌,廣泛分布于世界范圍的海水環(huán)境中,是多種經(jīng)濟(jì)魚類、蝦類和貝類的重要致病菌,其感染引發(fā)的病害使得水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)蒙受巨大經(jīng)濟(jì)損失。溶藻弧菌還是一種典型的人-畜-魚共患的致病微生物,會(huì)引起人的中耳炎、創(chuàng)傷性感染等疾病,直接對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅。Hfq是一類廣泛存在于細(xì)菌體內(nèi)、具有較高保守性的sRNA分子伴侶蛋白,具有轉(zhuǎn)錄后全局調(diào)控因子的功能,參與細(xì)菌多種生理功能的調(diào)控。前期研究發(fā)現(xiàn),Hfq對(duì)溶藻弧菌的多種生理功能有著不同程度的影響,而作為sRNA分子伴侶蛋白,Hfq主要通過(guò)各種sRNA分子對(duì)不同靶標(biāo)mRNA的影響來(lái)發(fā)揮其功能。本論文對(duì)前期在溶藻弧菌體內(nèi)篩查的5個(gè)sRNA,Qrr1-5進(jìn)行了分子克隆,根據(jù)同源交換的原理,利用自殺質(zhì)粒pDM4,通過(guò)無(wú)標(biāo)記基因缺失手段構(gòu)建了Δqrr1、Δqrr2、Δqrr3、Δqrr4、Δqrr5突變株;同時(shí)利用回補(bǔ)質(zhì)粒pBAD33成功構(gòu)建了其相應(yīng)的回補(bǔ)株qrr1~+、qrr2~+、qrr3~+、qrr4~+、qrr5~+;并初步鑒定其在溶藻弧菌不同生理功能中所發(fā)揮的作用。主要結(jié)果如下:以野生型溶藻弧菌EPGS020401的基因組為模板,擴(kuò)增獲得大小分別為121 bp,133 bp,134 bp,133 bp,134 bp5個(gè)s RNA序列,即Qrr1,Qrr2,Qrr3,Qrr4,Qrr5。對(duì)測(cè)序后的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),該5個(gè)sRNA分子與其它弧菌中相關(guān)序列具有較高的同源性,同時(shí)溶藻弧菌體內(nèi)5個(gè)qrr基因序列自身堿基組成具有一定的保守性,在其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-12到-24均含有σ54結(jié)合位點(diǎn)序列,在3’端均含有Rho非依賴型的終止子,其二級(jí)結(jié)構(gòu)均含有4個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu),4段互補(bǔ)序列。通過(guò)對(duì)靶標(biāo)基因的預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn),Qrr1-5與溶藻弧菌體內(nèi)多個(gè)靶基因存在潛在作用,影響其多種不同生理功能。成功構(gòu)建缺失qrr1基因開(kāi)放閱讀框內(nèi)115 bp,qrr2內(nèi)120 bp、qrr3內(nèi)139 bp、qrr4內(nèi)128 bp、qrr5內(nèi)129 bp的突變株Δqrr1、Δqrr2、Δqrr3、Δqrr4、Δqrr5及其回補(bǔ)菌株qrr1~+、qrr2~+、qrr3~+、qrr4~+、qrr5~+。通過(guò)比較其與野生型菌株不同表型的變化,初步鑒定了Qrr1-5對(duì)溶藻弧菌不同生理功能的調(diào)控作用。Qrr1-5基因缺失后,溶藻弧菌生長(zhǎng)速度和最大菌體濃度均明顯下降,即Qrr1-5在溶藻弧菌的整個(gè)生長(zhǎng)周期都發(fā)揮著重要的正調(diào)控作用,尤其是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。Δqrr1-5突變株的爬動(dòng)能力基本喪失,游動(dòng)能力則出現(xiàn)不同程度的損失,Δqrr1菌株的游動(dòng)能力幾乎完全喪失,Δqrr2、Δqrr3、Δqrr4菌株的游動(dòng)能力有所下降,而Δqrr5菌株游動(dòng)能力損失最小。Qrr3對(duì)溶藻弧菌生物被膜形成具有非常顯著的抑制作用,而Qrr2則具有顯著的抑制作用,Qrr1、Qrr4、Qrr5則對(duì)其影響不大。Qrr5對(duì)溶藻弧菌胞外蛋白酶的產(chǎn)生具有非常重要的促進(jìn)作用,而Qrr1-4則對(duì)其產(chǎn)生較小的影響。Qrr1-5對(duì)其響應(yīng)溫度(15°C和43°C)、30%蔗糖、限鐵環(huán)境等應(yīng)激能力影響不甚明顯。Qrr1-4對(duì)溶藻弧菌在10%乙醇?jí)毫ο碌纳�長(zhǎng)沒(méi)有明顯的影響,其生長(zhǎng)狀況與野生型基本相同,而Qrr5對(duì)溶藻弧菌響應(yīng)10%乙醇應(yīng)激能力具有一定的調(diào)控作用。SDS對(duì)溶藻弧菌的生長(zhǎng)抑制作用明顯,而其中Qrr2對(duì)溶藻弧菌響應(yīng)SDS應(yīng)激的能力具有一定的負(fù)調(diào)控作用。通過(guò)本論文的研究,初步明確了Qrr1-5對(duì)溶藻弧菌致病性相關(guān)表型和其他生理功能的作用,使人們對(duì)溶藻弧菌毒力調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)更加全面,而且為弧菌病的診斷和預(yù)防手段的開(kāi)發(fā)提供一定的理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：陜西科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q78;S941.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 張義全;AphA和OpaR對(duì)副溶血弧菌密度感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2014年

2 劉歡;溶藻弧菌群體感應(yīng)系統(tǒng)元件Hfq和LuxT的功能研究[D];華東理工大學(xué);2012年

3 錢榮華;溶藻弧菌主要毒力相關(guān)基因的克隆、表達(dá)及其免疫原性研究[D];浙江大學(xué);2007年

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本文編號(hào)：1324514