免疫印跡法(Western blot)是一種半定量分析生物組織蛋白質表達的比較常見的方法，也稱做酶聯(lián)免疫電轉移印斑法(Enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB)，因其與Southern首先建立的檢測核酸印跡的方法Southernblot相似，所以也被稱為Western—blot。它是一種將高分辨凝膠電泳和免疫化學分析技術結合起來的雜交技術。其特點為分析量大、靈敏度高、特異性強等，是檢測蛋白質特性表達及分布的常用方法，主要分3個階段進行，但由于該檢測方法步驟較繁瑣，實驗變量較多，結果不穩(wěn)定等特性，使得應用該法測定組織中的蛋白濃度時常常會遇到困難，花費大量的人力物力財力和時間去摸索實驗條件。其中，總蛋白的上樣量直接關系到實驗結果的可參照性以及后續(xù)步驟的反應靈敏度。目前，關于人血清總蛋白上樣量的參考范圍罕見報道，為此，本研究將探討人血清總蛋白上樣量的不同對實驗結果的影響。

　　1 材料與方法

　　1．1 材料：正常成年人新鮮血清標本(均采自廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院體檢科)，預染色標志蛋白質26618(美國Ther—mo公司)。

　　1．2 溶液：PBS緩沖液(20×)(購自生工生物)，BCA蛋白濃度測定試劑盒，SD PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)，SDSPAGE凝膠配制試劑盒，sD PAGE電泳液，考馬斯亮藍染色液，考馬斯亮藍染色脫色液(均購自碧云天生物技術研究所)。

　　1．3 儀器：E1x800自動酶標儀(美國Bio—Tek Instruments公司)，96孔板(碧云天生物技術研究所)，制膠器(美國Bio—Rad公司)，電泳儀(美國Bio—Rad公司)，雙向電泳系統(tǒng)(美國Bio Rad公司)。

　　1．4 方法

　　1．4．1 BCA法測定樣本血清總蛋白濃度。

　　1．4．2 標本處理：將正常成人新鮮血清分裝，用1×PBS緩沖液分別將血清稀釋2倍、5倍、1O倍及2O倍，按4：1加入SDS—PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)，沸水悶煮3 min，10 000r／min離心3 min，常溫預冷。

　　1．4．3 制膠：常規(guī)方法配置5 濃縮膠以及6 分離膠，膠厚1．0 mm 。

　　1．4．4 上樣：等體積上樣，每孔上樣5L。

　　1．4．5 電泳：恒壓電泳，濃縮膠80 mV，分離膠120 mV。

　　1．4．6 染膠：將膠取出置于水平搖床上緩慢搖動，用考馬斯亮藍染色液染色2 h。

　　1．4．7 脫色：倒出染色液，置于水平搖床上緩慢搖動，用考馬斯亮藍染色脫色液脫色過夜，期間更換脫色液3次，直至藍色背景全部被脫去。

　　1．4．8 拍照：倒出脫色液，用雙蒸水洗滌，置于雙向電泳系統(tǒng)中，拍照。

　　1．5 實驗條件控制：嚴格地控制實驗條件，其中包括：采用比較準確的BCA法測定總蛋白濃度，且多次測量求平均值；溶液配制采用去離子水，膠體的配制采用純水；相同條件電泳至少重復試驗3次；所有操作步驟所使用到的儀器均為同一套裝置；所有使用到的溶液均為一次性使用，且現(xiàn)用現(xiàn)配。

　　2 結 果

　　2．1 樣本血清總蛋白濃度測量3次，分別為5O．11，5O．04，49．88 g／L。平均蛋白濃度5O．01 g／L。

　　2．2 稀釋不同倍數(shù)的正常成年人血清總蛋白等體積上樣后的電泳結果，見圖1。圖1顯示，血清總蛋白上樣量的不同直接影響到目的條帶的可辨識度：以原血清(50．01 g／L)上樣5“L其中含SDSPAGE蛋白上樣緩沖液(5×)1 L，下同，上樣總蛋白量200g，電泳所得條帶拖帶現(xiàn)象嚴重，在不同分子量處沒有明顯的單一蛋白條帶顯現(xiàn)，無法辨識目的蛋白條帶，影響后續(xù)分析；以2倍稀釋血清(25．00 g／L)上樣，上樣總蛋白量100／xg，拖帶現(xiàn)象仍然存在，但已隱約可見若干蛋白條帶顯現(xiàn)，似稍有彎曲變形；以5倍稀釋血清(10．00 g／L)上樣 ，上樣總蛋白量4O g，電泳后可見蛋白條帶清晰，邊緣規(guī)整無形變；以1O倍稀釋血清(5．00 g／L)上樣5gI ，上樣總蛋白2O g，電泳后蛋白條帶清晰；以2O倍稀釋血清(2．5Og／L)上樣5／L，上樣總蛋白1O g，電泳所呈現(xiàn)條帶顏色較淺，提示蛋白總量不足，影響后續(xù)定量分析的靈敏度。

　　3 討 論

　　Western blot是一種分析生物組織蛋白質表達比較常見的方法，常常作為篩選出的差異蛋白的后續(xù)驗證工作。

　　我們針對實驗條件階段比較重要的影響因素，即人血清總蛋白不同的上樣量進行研究，比較不同的上樣量產(chǎn)生的實驗結果。結果顯示：當上樣的總蛋白量大于100 g時，SDSPAGE凝膠不能很好的區(qū)分不同分子量的蛋白質，分離效率下降，影響后續(xù)分析操作的進行；當上樣的總蛋白量在2o～100 g之間時，分離出的各分子量蛋白質條帶清晰，此時分離效率較高；當上樣的總蛋白量在l0 g及其以下時，分離出的各分子量蛋白質條帶顏色較淺，提示蛋白總量過低，不利于后續(xù)分析步驟的進行，筆耕論文新浪博客，降低了測試靈敏度。所以，大多有關Western blot的實驗都選用2O～ 100 g這一總蛋白上樣量來進行研究，提示總蛋白上樣量直接關系著實驗的成功與否，與所研究的蛋白種類和組織來源并無直接聯(lián)系。

　　因此，本實驗較好的闡明了Western blot中總蛋白上樣量的大小與后續(xù)實驗的關系，為今后同類實驗的開展提供了參考。

　　6 SDS-PAGE凝膠最佳分離范圍是分子量在5O～150 ku的蛋白質。本次試驗中，筆者選擇6 的SDS-PAGE凝膠用以分離人血清蛋白質主要是考慮人血清中5O～ 150ku的蛋白質相對其他分子量區(qū)間較少，可以較清楚的顯示出由于上樣量不同而導致的不同結果，不會因條帶過多影響結果的觀察。

　　本次試驗作者將電泳時的電壓固定為濃縮膠8O mV、分離膠120 mV，主要是考慮選取5O～150 ku中間的100 ku分子量蛋白質的參考電壓進行跑膠，以利于人血清中各蛋白質組分的分離。