發(fā)布時(shí)間：2020-12-27 04:39

　　目的:研究成骨細(xì)胞與誘導(dǎo)劑對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞（MSCs）的增殖與分化的影響,探索一種新的骨組織工程種子細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系。方法:骨髓基質(zhì)細(xì)胞由于其強(qiáng)大增殖能力及多向分化潛能而成為骨組織工程的種子細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)研究乳大鼠顱骨來(lái)源的成骨細(xì)胞與誘導(dǎo)劑（地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸）對(duì)大鼠股骨、脛骨來(lái)源的MSCs生長(zhǎng)的影響。實(shí)驗(yàn)共分4組,對(duì)照組:DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)MSCs;誘導(dǎo)劑組:成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)MSCs;成骨細(xì)胞組:在DMEM培養(yǎng)液中通過(guò)插入式培養(yǎng)皿以2:1的比例間接混合培養(yǎng)MSCs和成骨細(xì)胞,細(xì)胞因子可通過(guò)培養(yǎng)皿底部半透膜的微孔;聯(lián)合誘導(dǎo)組:在成骨誘導(dǎo)液中進(jìn)行如成骨細(xì)胞組的細(xì)胞間接混合培養(yǎng)。計(jì)數(shù)培養(yǎng)8d內(nèi)每天的MSCs數(shù)量,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線;檢測(cè)培養(yǎng)10d時(shí)MSCs的堿性磷酸酶（ALP）活性;檢測(cè)細(xì)胞總蛋白量,計(jì)算ALP相對(duì)活性（即單位質(zhì)量蛋白的ALP活性）;采用逆轉(zhuǎn)錄酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)培養(yǎng)2w后MSCs的骨鈣素（OC）mRNA的表達(dá)量。結(jié)果:生長(zhǎng)曲線顯示8d內(nèi)4組細(xì)胞數(shù)量均隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加。3個(gè)誘導(dǎo)組分別與對(duì)照組比較:后4d內(nèi)誘導(dǎo)劑組的細(xì)胞數(shù)量少于對(duì)照組而成骨細(xì)胞組的細(xì)胞數(shù)... 

【文章來(lái)源】：東南大學(xué)江蘇省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

插入式培養(yǎng)皿置于24孔板中Fig1MillicellCellCulturePlateInsertin

3.2.3 干預(yù)實(shí)驗(yàn)3.2.3.1 干預(yù)前的準(zhǔn)備插入式培養(yǎng)皿使用前在 DMEM 培養(yǎng)液中浸泡 2h。骨髓基質(zhì)細(xì)胞的制備胰蛋白酶溶液消化生長(zhǎng)良好的第 3 代骨髓基質(zhì)細(xì)胞，胎牛血清終止消化，PB2 次，用 DMEM 培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞至密度為 5×104/ml，以每孔 1ml 細(xì)胞懸液孔板，共種植 4 塊。培養(yǎng) 24 小時(shí)后備用。成骨細(xì)胞的制備：以上相同方法制×104/ml 的成骨細(xì)胞懸液，取 2 塊 24 孔培養(yǎng)板，每孔先加入 0.5ml DMEM 放入插入式培養(yǎng)皿，皿中加入 0.5ml 已制備好的成骨細(xì)胞懸液，培養(yǎng) 24 小骨髓基質(zhì)細(xì)胞與成骨細(xì)胞預(yù)培養(yǎng) 24h 利于細(xì)胞的適應(yīng)誘導(dǎo)環(huán)境及同步化。3.2.3.2 干預(yù)過(guò)程吸去上述培養(yǎng)板及培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，PBS 緩沖液洗 2 次。以每塊有胞的 24 培養(yǎng)板對(duì)應(yīng)一組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組：每孔加入 1ml DMEM 培養(yǎng)液；每孔加入 1ml 成骨誘導(dǎo)液；成骨細(xì)胞組：每孔先加入 0.5mlDMEM 培養(yǎng)液，骨細(xì)胞的 Millipore 插入式培養(yǎng)皿，皿中再加入 0.5mlDMEM 培養(yǎng)液 (圖 1)，細(xì)胞因子可通過(guò)插入式培養(yǎng)皿底部的半透膜（圖 2）；聯(lián)合誘導(dǎo)組：每孔先加成骨誘導(dǎo)液，放入已有成骨細(xì)胞的 Millipore 插入式培養(yǎng)皿，皿中再加入 0.導(dǎo)液。每隔 3 天換液，使用培養(yǎng)孔中原用的相應(yīng)培養(yǎng)液換液，有插入式培養(yǎng)培養(yǎng)皿內(nèi)外各加 0.5ml 培養(yǎng)液的方法換液。以上所用培養(yǎng)液均含 20﹪的胎牛插

東南大學(xué)碩士學(xué)位論文四 結(jié) 果4.1 成骨細(xì)胞的鑒定4.1.1 形態(tài)學(xué)觀察消化法所得的細(xì)胞種植24h后即可見(jiàn)大量細(xì)胞貼壁,少量死細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中,貼壁細(xì)胞呈三角形、多邊形、不規(guī)則形(圖 4)。第 3 d 換液可除去懸浮細(xì)胞，培養(yǎng) 1w 細(xì)胞即可長(zhǎng)滿瓶壁。植塊法：骨組織塊種植于瓶壁 2d 后可見(jiàn)少量梭形細(xì)胞從植塊邊緣爬出，細(xì)胞成輻射狀分布,培養(yǎng) 2w 相鄰的植塊長(zhǎng)出的細(xì)胞匯合。傳代培養(yǎng)的細(xì)胞一般 24h 內(nèi)即已貼壁，細(xì)胞出現(xiàn)突起,培養(yǎng) 3d 左右細(xì)胞即可融合,1w 后細(xì)胞呈多層生長(zhǎng),鑲嵌排列,, 細(xì)胞外基質(zhì)分泌增多，并包裹細(xì)胞, 10d 后呈現(xiàn)明顯“鋪路石”狀（圖 5）,2w 后細(xì)胞間出現(xiàn)致密圓形結(jié)節(jié), 結(jié)節(jié)逐漸增大呈黑色團(tuán)塊,團(tuán)塊呈突起的多層結(jié)構(gòu),輪廓模糊,中心區(qū)透光性弱，黑色團(tuán)塊即為鈣結(jié)節(jié)。


本文編號(hào)：2941118