發(fā)布時間：2019-07-12 09:14

【摘要】：本研究通過四個試驗,觀測了在不同溫度下鋅對原代培養(yǎng)肉雞雞胚肝細胞抗氧化性能及相關的分子指標的影響,從細胞水平探討了鋅對肉雞抗熱應激效應及分子機制。試驗一旨在通過建立可靠的肉雞雞胚熱敏肝細胞模型,并觀測肝細胞的持續(xù)活力,為后續(xù)研究鋅對原代培養(yǎng)肉雞雞胚肝細胞抗熱應激效應及分子機制奠定基礎。本試驗用14胚齡雞胚分離得到雞胚肝細胞,并接種到六孔培養(yǎng)板培養(yǎng)。臺盼藍染色顯示,細胞活率高達95%;糖原染色結果顯示,分離得到了純度理想的雞胚肝細胞;肝細胞可在培養(yǎng)到72h后匯合成單層,模型構建成功后肝細胞的活力可穩(wěn)定維持3天,滿足開展后續(xù)試驗的條件。試驗二旨在確定原代培養(yǎng)肉雞雞胚肝細胞最佳的鋅添加水平及鋅作用的最佳時間,為后續(xù)研究鋅對原代培養(yǎng)肉雞熱敏雞胚肝細胞的抗熱應激效應及其分子機制奠定理論基礎。本試驗采用5×3兩因子完全隨機試驗設計,肝細胞培養(yǎng)設5個添加鋅水平(0、50、100、200和400μM硫酸鋅形態(tài)的鋅)與3個鋅作用時間(12、24和48 h),共15個處理組,將同一處理的2個重復孔細胞收集到一個滅菌離心管中作為一個重復樣品,每組6個重復。結果表明:在作用時間為12 h時、鋅水平為50μM時銅鋅超氧化物歧化酶(CuZnSOD)活性顯著高于其它各處理組(P0.05);與對照組相比,加鋅水平為50、100、200和400μM均顯著上調了肝細胞金屬硫蛋白(MT)mRNA的表達(P0.0001),而四個添加水平之間并無顯著差異(P0.05)。根據以上結果,選擇鋅添加水平為50μM,作用時間為12h研究后續(xù)鋅對肝細胞的抗熱應激分子機制。試驗三旨在研究熱應激狀態(tài)下肝細胞熱休克蛋白(HSP70、90)mRNA相對表達量及培養(yǎng)上清乳酸脫氫酶(LDH)活性隨培養(yǎng)時間的變化,以確定原代培養(yǎng)肉雞雞胚肝細胞受到熱應激影響的最佳時間,為后續(xù)研究鋅對原代培養(yǎng)肉雞熱敏雞胚肝細胞的抗熱應激效應及其分子機制奠定基礎。試驗采用2×5兩因子完全隨機設計。試驗設2個雞胚肝細胞培養(yǎng)溫度(40℃常溫和44℃高溫)與5個處理時間(1、2、4、6和8小時),共10個處理組。將同一處理的2個重復孔的細胞培養(yǎng)液和細胞收集到一個滅菌離心管中作為一個重復樣品,每組6個重復。結果表明:培養(yǎng)時間分別為4、6、8 h時,與常溫組相比,高溫組顯著提高肝細胞培養(yǎng)液LDH酶活(P0.0001);在熱應激(44℃)狀態(tài)下,培養(yǎng)4 h以內,隨著培養(yǎng)時間的增加肝細胞HSP70 mRNA相對表達量顯著升高(P0.034);在熱應激狀態(tài)下肝細胞HSP 90 mRNA相對表達量隨培養(yǎng)時間的增加而顯著升高(P0.023),在培養(yǎng)6 h達到最高,后又顯著降低(P0.0008)。根據以上結果,選擇熱應激時間為4、6 h作為后續(xù)鋅對肝細胞的抗熱應激分子機制。試驗四采用2×3×2三因子完全隨機設計。設2個雞胚肝細胞培養(yǎng)溫度(40℃和44℃)、3種鋅源處理(不添加鋅、50μM ZnSO4以及50μM中等鰲合強度Zn-Lys)與2個熱應激處理時間(4 h與6 h),共12個處理組,每組6個重復。結果表明,在常溫情況下,與未添加鋅組相比,添加ZnSO4提高了肝細胞CuZnSOD酶活(P=0.0048)。在高溫情況下,添加Zn-Lys組肝細胞CuZnSOD酶活顯著高于未添加鋅組及ZnSO4組(P=0.049);與常溫相比,高溫顯著升高了肝細胞MDA含量(P=0.006)。與未加鋅組相比,加鋅均能顯著提高肝細胞MT mRNA的表達量(P0.035);與常溫組相比,高溫顯著提高了肝細胞HSP70 mRNA的表達量(P0.0001)。在高溫情況下,與未加鋅組相比,添加ZnSO4組顯著降低了HSP70 mRNA表達量(P0.05);在常溫情況下,添加Zn-Lys組HSP90 mRNA的表達量顯著低于未加鋅和加ZnSO4組(P0.005)。在高溫情況下,處理4h時,ZnSO4組HSP90 mRNA的表達量顯著低于未加鋅組和Zn-Lys組(P0.0003);與常溫組相比,高溫顯著提高了肝細胞HSP70蛋白表達(P0.0001)。在高溫處理6h時,添加ZnSO4組及ZnLys組顯著下調了肝細胞HSP70蛋白表達(P0.0001)。綜上所述,加鋅可提高肉雞雞胚肝細胞抗氧化能力;熱應激引起肉雞雞胚肝細胞氧化損傷;加鋅緩解了熱應激引起肉雞雞胚肝細胞氧化損傷。
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圖片說明：技術路線圖
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圖片說明： 培養(yǎng) 48 h 培養(yǎng) 72 h圖 2.1 肝細胞形態(tài)學觀察細胞糖原染色鑒定細胞糖原染色鑒定結果見圖 2.2。肝細胞胞質內含有豐富的糖原，糖原染成紫紅色。微鏡觀察到陽性組視野中細胞 90%以上呈紫紅色，而陰性組并未，表明分離培養(yǎng)的肝細胞有較高的純度。
【學位授予單位】：甘肅農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S831.5

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本文編號：2513613