發(fā)布時間：2020-11-21 19:18

　　 豬偽狂犬病(Pseudorabies,PR)是由豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一種豬傳染病,其臨床癥狀主要為妊娠母豬發(fā)生流產和仔豬出現神經癥狀,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失。自上世紀90年代我國豬群通過免疫疫苗而有效控制該病,但自2011年下半年以來,在我國黑龍江、吉林、河南、江蘇等多個省份的免疫Bartha-K61疫苗的豬場相繼爆發(fā)了PR。2012年,本實驗室于河南某免疫Bartha-K61疫苗豬場分離出一株PRV,命名為HeN1株,并證明疫苗Bartha-K61不能對HeN1感染提供完全的保護。此后,國內多個實驗室也相繼分離到了類似毒株。然而目前,對我國PRV當前流行毒株的分子特征、遺傳變異情況尚不清楚。本研究對PRV HeN1株進行了全基因組測序和注釋。同時將HeN1序列與僅有的5條PRV完整基因組序列和1條90%以上完整序列進行了全基因組水平上的比較分析。分析結果表明,與國外毒株相比HeN1有多處插入、缺失。同時本研究設計了多對覆蓋插入、缺失區(qū)域的引物,驗證了多株國內不同時期和省份的PRV分離株也存在這些缺失、插入。國內毒株的這種缺失、插入特征提示我國流行的PRV與國外毒株之間存在著明顯的差異。本研究進而對PRV又進行了系統(tǒng)分型研究。國外學者利用兩種不同分型方法對PRV進行過較詳細分型研究,然而我國毒株尚未有分型的報道。本研究利用限制性片段多態(tài)性(RFLP)分型方法和gC遺傳進化分類方法對PRV進行了分型研究。首次指出,我國流行的PRV與國外PRV毒株分別屬于兩個不同的基因亞型:國外毒株主要屬于基因Ⅰ型,中國毒株主要屬于基因Ⅱ型。HeN1和Bartha-K61的血清對這兩株病毒的交叉中和實驗結果也表明這兩株病毒間存在一定的抗原性差異。感染和毒力相關基因的遺傳變異表明我國PRV流行株的感染和毒力相關基因具有相似的分子特征,與我國早期PRV相應基因同源性較高。相比之下,國外毒株與國內毒株間各相關基因有較大突變和缺失、插入,二者進化關系較遠。簡單重復序列(simple sequence repeats,SSR)是用來分析皰疹病毒遺傳變異的重要分子特征。本研究對PRV全基因組序列的SSR進行了全面的分析和比較。結果表明SSR在3株中國毒株和3株國外毒株間存在很大差異,而在各基因型內部差別較小。SSR廣泛參與了PRV基因組的變異,并導致兩基因型間很多特征插入缺失區(qū)域的產生。我們還比較了單純皰疹病毒Ⅰ型(HSV-1)和PRV這兩種病毒的同源蛋白在毒株間的變異性,我們發(fā)現PRV編碼蛋白在株間變異性比HSV-1編碼的相應蛋白的變異性高很多,這在α皰疹病毒中是很少見的。本研究在全基因組水平上對我國流行PRV的遺傳變異情況進行分析,據此將PRV分為兩個基因型:Ⅰ型主要為國外毒株,Ⅱ型主要為國內毒株。這也是Bartha-K61疫苗(Ⅰ型)對國內當前流行株(Ⅱ型)不能完全保護的重要原因。本研究促進了對我國PRV的分子特征、遺傳背景的認識,同時也為PRV防控的策略制定、新疫苗的開發(fā)提供了重要的科學依據。
【學位單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：S852.65
【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 豬偽狂犬病的發(fā)生、發(fā)展歷史
    1.2 豬偽狂犬病病毒的生物學特征
        1.2.1 豬偽狂犬病病毒的分子生物學特性
        1.2.2 豬偽狂犬病病毒的培養(yǎng)特性
        1.2.3 豬偽狂犬病病毒的感染特性
        1.2.4 豬偽狂犬病病毒的臨床癥狀和病理變化
    1.3 豬偽狂犬病病毒的血清和基因分型
    1.4 診斷和疫苗研究
    1.5 研究目的及意義
第二章 PRV HeN1株全基因組測序和注釋及其插入缺失特征的驗證
    2.1 材料和方法
        2.1.1 病毒和細胞
        2.1.2 菌株、試劑與載體
        2.1.3 主要設備儀器
        2.1.4 病毒基因組DNA的提取及純化
        2.1.5 引物設計
        2.1.6 病毒基因組分段PCR擴增
        2.1.7 感受態(tài)細胞的制備
        2.1.8 PCR產物的回收、克隆和測序
        2.1.9 測序結果拼接和基因組注釋
        2.1.10在中國其他毒株上驗證He N1特異插入缺失區(qū)域
    2.2 結果
        2.2.1 病毒基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳
        2.2.2 基因組序列分段PCR擴增結果
        2.2.3 PRV HeN1全基因組序列的獲得
        2.2.4 PRV HeN1基因注釋
        2.2.5 在中國其他毒株上驗證He N1特異插入缺失區(qū)域
    2.3 討論
第三章 以HeN1為代表的中國PRV毒株與國外毒株的比較基因組分析
    3.1 材料和方法
        3.1.1 毒株序列
        3.1.2 中國毒株與國外毒株全基因組水平差異比較
        3.1.3 HeN1株和歐美毒株的蛋白編碼序列比較分析
        3.1.4 HeN1與Kaplan、Becker、Bartha、JS、TJ和BJ/YT差異氨基酸的比較分析
        3.1.5 中國毒株與國外參考毒株之間微衛(wèi)星序列（SSR）的比較分析
        3.1.6 PRV和HSV-1 編碼蛋白的變異性比較
        3.1.7 限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）
        3.1.8 PRV遺傳進化分析
        3.1.9 PRV Bartha和HeN1株間的交叉中和實驗
    3.2 結果
        3.2.1 中國毒株與國外毒株全基因組水平差異比較
        3.2.2 國內外PRV毒株相應的各蛋白編碼序列間有顯著的氨基酸變異
        3.2.3 SSR在中國毒株與國外參考毒株之間的比較分析
        3.2.4 PRV和HSV-1 所編碼的蛋白在毒株間的變異性比較
        3.2.5 PRV的基因分型
        3.2.6 偽狂犬病病毒的進化速率
        3.2.7 Bartha和HeN1免疫豬產生的抗血清對這兩株病毒的交叉保護力研究
    3.3 討論
第四章 豬偽狂犬病病毒HeN1株感染和毒力相關基因的變異特征分析
    4.1 材料和方法
        4.1.1 序列信息
        4.1.2 PRV感染和毒力相關基因的比對分析
        4.1.3 PRV序列的進化樹分析
    4.2 結果
        4.2.1 HeN1與國內外參考株的各相關基因核苷酸同源性比較
        4.2.2 PRV感染和毒力相關蛋白的變異特征
        4.2.3 PRV各基因進化樹分析
    4.3 討論
第五章 全文結論
參考文獻
附錄
    附錄表S1分段擴增HeN1全基因組的引物
    附錄表S2 HeN1株與國內外毒株Kaplan、Bartha、Becker、BJ/YT、TJ和JS蛋白編碼差異比較表
    附錄表S3國外毒株Kaplan、Bartha和Becker與HeN1相比各蛋白變異氨基酸數量表
    附錄表S4 PRV和HSV-1 基于貝葉斯算法估算得到替換率和各自毒株間最近分化時間
    附錄圖S1所有PRV毒株基于66個基因構建的的進化樹
致謝
作者簡歷

【參考文獻】

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1 孫瑞;趙恒章;馬金友;李培慶;余燕;;豬偽狂犬病的組織病理學觀察[J];貴州農業(yè)科學;2009年03期

本文編號：2893474