發(fā)布時(shí)間：2020-11-18 21:46

　　 研究背景： 神經(jīng)管畸形(NTD)是一類發(fā)病率高且后果嚴(yán)重的先天畸形,受遺傳和環(huán)境交互作用的影響。孕婦葉酸缺乏是導(dǎo)致NTD的原因之一,但是在孕婦葉酸不缺乏的情況下,仍有一些因素可導(dǎo)致NTD發(fā)生。表觀遺傳修飾在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起了重要作用,PcGs (Polycomb groups)蛋白被認(rèn)為是其核心部分。目前,人們多關(guān)注PcG蛋白是通過(guò)影響下游基因參與細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育,卻很少有人報(bào)道上游哪些機(jī)制調(diào)控著PcG蛋白表達(dá)。MicroRNAs (miRNAs)是一類與轉(zhuǎn)錄后基因沉默有關(guān)的小RNA分子。MiRNAs是否在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中能夠調(diào)節(jié)PcG蛋白的表達(dá)目前仍不清楚。此外,PcG蛋白與細(xì)胞凋亡密切相關(guān),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,神經(jīng)上皮細(xì)胞凋亡過(guò)度,是導(dǎo)致神經(jīng)管閉合延遲,引發(fā)NTD。細(xì)胞凋亡是否與胎兒NTD發(fā)生直接相關(guān)目前仍不清楚。本研究從PcG蛋白的表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞凋亡兩個(gè)角度深入探討導(dǎo)致神經(jīng)管畸形發(fā)生的分子機(jī)制。 研究目的： 在母親葉酸不缺乏的情況下,研究PcGs家族蛋白在神經(jīng)管畸形兒神經(jīng)和胎盤組織中的表達(dá)調(diào)控,探討神經(jīng)管畸形兒發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)和胎盤組織中細(xì)胞凋亡的發(fā)生規(guī)律。 研究方法： 1.利用電化學(xué)發(fā)光法,檢測(cè)NTD組和對(duì)照母親血清葉酸水平。 2.利用Western blot技術(shù),檢測(cè)Polycomb家族核心蛋白EZH2,SUZ12,EED和BMI1在NTD兒和對(duì)照組兒神經(jīng)組織和胎盤組織中的表達(dá)。 3.利用PicTar,Targetscan和miRanda等生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)可能調(diào)節(jié)表達(dá)異常的PcG蛋白—EED的microRNA(miRNA)。 4.運(yùn)用TaqMan MicroRNA Arrays檢測(cè)預(yù)測(cè)的靶基因?yàn)镋ED的miRNA在胎盤和神經(jīng)組織中的表達(dá)。 5.利用RT-Realtime PCR、Western blot、雙熒光素酶活性分析等分子生物學(xué)方法驗(yàn)證miRNAs與EED的相互作用。 6.利用原位末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)研究NTD組和對(duì)照組在胎盤組織和神經(jīng)組織中的細(xì)胞凋亡發(fā)生狀況。 研究結(jié)果： 1.NTD組和對(duì)照組母親血清葉酸水平均在正常范圍內(nèi),且兩組之間無(wú)明顯差異(P=0.4464)。 2.EZH2,SUZ12,BMI1,EED蛋白在NTD組和對(duì)照組的胎盤和神經(jīng)組織均有不同程度的表達(dá)。其中,發(fā)現(xiàn)EED蛋白在NTD組胎盤、大腦皮質(zhì)、脊髓組織中均存在差異表達(dá),在NTD組的胎盤和脊髓組織中表達(dá)明顯升高(P0.05),在大腦皮質(zhì)中表達(dá)顯著降低(P0.05)。 3.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-30b,miR-30c and mi-R181b的靶基因可能為Eed,這些miRNAs與Eed的3'UTR互補(bǔ)的"seed"片段在不同物種間是高度保守的。 4. miRNA與其靶基因存在反向調(diào)節(jié)關(guān)系,為了分析預(yù)測(cè)的miRNAs哪些可能調(diào)節(jié)EED的表達(dá),TaqMan MicroRNA Arrays是被用來(lái)檢測(cè)miRNA在胎盤和神經(jīng)組織中的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)miR-30b在脊髓組織和大腦皮質(zhì),miR-30c胎盤組織及miR-181b在脊髓組織中與EED存在反向表達(dá),提示了miR-30b,miR-30c和miR-181b均有可能調(diào)控EED的表達(dá),其調(diào)控關(guān)系可能受組織特異性影響。 5.雙熒光素酶活性分析顯示,miR-30b和miR-30c與包含"seed"片段PGL3-EED3'-UTR的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞能顯著降低酶活性,提示miR-30b和miR-30c的"seed"片段作用于Eed的3'-UTR區(qū),Eed為miR-30b和miR-30c的靶基因。 6.利用Western blot和Real Time PCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)或敲低miR-30b,miR-30c或miR-181b后內(nèi)源性EED蛋白和mRNA水平的表達(dá)發(fā)現(xiàn),升高miR-30b或miR-30c,EED蛋白水平明顯下調(diào)(P0.05)；降低miR-30b或miR-30c,EED蛋白水平明顯上調(diào)(P0.05),其mRNA水平均沒有明顯變化。無(wú)論升高或降低mi-R181b,EED蛋白水平和mRNA水平均沒有明顯變化。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了miR-30b和miR-30c均可調(diào)節(jié)EED的表達(dá)。 7.在體研究胎盤和神經(jīng)組織中的細(xì)胞凋亡水平發(fā)現(xiàn),在大腦皮質(zhì)NTD組的細(xì)胞凋亡指數(shù)低于對(duì)照組(p0.05)；胎盤絨毛組織細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯大于正常胎盤絨毛組織的細(xì)胞凋亡指數(shù)(p0.01)。 結(jié)論： 1、在非葉酸缺乏的神經(jīng)管發(fā)育缺陷過(guò)程中,Polycomb家族蛋白表達(dá)分布具有組織特異性,且EED蛋白在胎盤和神經(jīng)組織中均存在差異表達(dá)。 2、在非葉酸缺乏的神經(jīng)管發(fā)育缺陷過(guò)程中,miR-30b在NTD組神經(jīng)組織中差異表達(dá),miR-30c在NTD胎盤組織中差異表達(dá)。 3、首次證實(shí)EED是miR-30b和miR-30c的靶基因,且miR-30b和miR-30c可以調(diào)節(jié)內(nèi)源性EED的表達(dá)。 4、在非葉酸缺乏的神經(jīng)管發(fā)育缺陷過(guò)程中,NTD的發(fā)生與胎盤和神經(jīng)組織中異常的細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。
【學(xué)位單位】：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R748
【部分圖文】：

圖1EzHZ、suzlZ、BMll和EEn在胎盤，大腦皮質(zhì)和脊髓組織中的表達(dá)Fig.lEZHZ，SUZ12，BMllandEEDexPressioninPlaeetaandneuraltissuesinhuman.w亡StemblottingwasusedanalyzedtheexPressionoftheEzhZSUZ12BMlandEEDinPlacenia，eerebralcortex，sPinaleordfromPregnantwomenwithbabiesonormality(eonirol)andNTD(NTD).ThebandswereanalysedusingtheQuantityOn

提示了ml’R一30b，ml’R一30c和mi一Isjb均有可能調(diào)控EED的表達(dá)，其調(diào)控關(guān)系可能受組織特異性影響，miR一30b和mi一R了Slb可能主要在神經(jīng)組織中發(fā)揮作用，ml’R一30c可能主要在胎盤組織中發(fā)揮作用。(圖3)。根據(jù)在NTD神經(jīng)組織和胎盤組織中miRNAS與EED表達(dá)趨勢(shì)相反的現(xiàn)象和軟件預(yù)測(cè)的兩者之間存在結(jié)合位點(diǎn)，為驗(yàn)證兩者之間的關(guān)系，我們?cè)谌松窠?jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U343細(xì)胞系)中利用雙熒光素酶活性分析和改變內(nèi)源性miRNAs觀察對(duì)內(nèi)源性EED表達(dá)的影響。3、Eed3，uTR質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒的熒光素酶活性測(cè)定3.1過(guò)表達(dá)或敲低m1RNA后U343細(xì)胞系內(nèi)miRNA的改變利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的ml’R一勿b，miR一30c，或miR一ISIb的模擬物和抑制物后，使用 ABITaqmanmicroRNAassays測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的miRNA水平，確定其內(nèi)源性miRNA表達(dá)是否改變。結(jié)果顯示，當(dāng)轉(zhuǎn)染ml’R一30b

miRNA表達(dá)是否改變。結(jié)果顯示，當(dāng)轉(zhuǎn)染ml’R一30b，ml’R一30c或ml’R181b的模擬物后，U343細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的而RNA確表達(dá)升高。同樣，當(dāng)轉(zhuǎn)染miR一了0b，miR一了0c或miR一ISIb抑制物后，U343細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的miRNA水平降低(圖4)。說(shuō)明miR一了0b，miR一刃c，ml’R一ISIb模擬物和抑制物有效，我們能成功過(guò)表達(dá)或敲低細(xì)胞內(nèi)miRNA水平。 3.2Eed3，UTR質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒的熒光素酶活性測(cè)定構(gòu)建了包含預(yù)測(cè)的與ml’R一勿b，miR一 30candmi一I81b的“seed”互補(bǔ)的Eed的3憶uTR片段的PoL3一promoter-EEn3幾u(yù)TR的質(zhì)粒(EED一luc)以及對(duì)照的敲除該‘，seed’，片段的質(zhì)粒(EED一luc一di)。將miRNA模擬物
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 馬金龍,高英茂,劉凱,武玉玲,高彥慧;高溫致金黃地鼠神經(jīng)管畸形中細(xì)胞凋亡的組織學(xué)觀察[J];解剖學(xué)報(bào);1998年03期

2 Dasari Vasanthi;Rakesh K Mishra;;Epigenetic regulation of genes during development: A conserved themefrom flies to mammals[J];遺傳學(xué)報(bào);2008年07期

3 楊立業(yè),劉相名,惠國(guó)楨,趙文娟,費(fèi)儉,郭禮和;人類神經(jīng)干細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)和傳代[J];中華神經(jīng)外科雜志;2002年05期

本文編號(hào)：2889240