發(fā)布時(shí)間：2020-11-17 05:41

　　 目的:目前已有研究證實(shí)與正常孕婦相比,子癇前期孕婦外周血胎盤源性微囊泡(placental-derived microvesicles,pcMVs)水平明顯升高。同時(shí)文獻(xiàn)研究采用胎盤絨毛組織機(jī)械震蕩、絨毛組織體外培養(yǎng)和胎盤子葉灌注三種不同方法制備胎盤源性微囊泡進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)胎盤源性微囊泡可能與內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、炎癥反應(yīng)和凝血纖溶失衡有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)在上述三種制備方法的基礎(chǔ)上,以及參考腦源性微囊泡的制備方法,采用凍存絨毛組織研磨法制備胎盤源性微囊泡,并且與重度子癇前期孕婦外周血微囊泡進(jìn)行對(duì)比鑒定,觀察兩者在形態(tài)以及功能活性的差異。探討建立一個(gè)改良型制備方法,利于體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行胎盤源性微囊泡與子癇前期發(fā)病機(jī)制相關(guān)性研究。方法:1)正常孕婦剖宮產(chǎn)時(shí)取胎盤組織,采用免疫組織化學(xué)法鑒定選取的樣本組織為絨毛組織;2)胎盤絨毛組織采用組織勻漿器研磨分步離心的方法體外制備pcMVs,同時(shí)抽取重度子癇前期孕婦外周血分步離心的方法體外制備外周血微囊泡;3)用透射電鏡、流式細(xì)胞儀和Nanosight方法鑒定所得的研磨法pcMVs和外周血微囊泡的形態(tài)學(xué)及表型;4)用半自動(dòng)凝血儀TS6000,體外檢測(cè)研磨法pcMVs和外周血微囊泡兩組的凝血酶原時(shí)間(Prothrombin time,PT),比較促凝活性;5)應(yīng)用Transwell小室系統(tǒng)檢測(cè)研磨法pcMVs和外周血微囊泡穿透人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)的能力;6)應(yīng)用離子電導(dǎo)顯微鏡觀察研磨法pcMVs和外周血微囊泡兩組分別對(duì)HUVEC之間的細(xì)胞連接以及細(xì)胞形態(tài)的影響。結(jié)果:1)免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示胎盤組織能表達(dá)合體滋養(yǎng)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物---胎盤堿性磷酸酶,證實(shí)選取部位的組織為絨毛組織;2)胎盤絨毛組織研磨制備的pcMVs和子癇前期外周血離心制備的微囊泡在透射電鏡下觀察均具有膜結(jié)構(gòu);3)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示胎盤研磨法制備的pcMVs能表達(dá)大量的合體滋養(yǎng)細(xì)胞特異性標(biāo)記物,而基本不表達(dá)血小板、紅細(xì)胞、白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物。子癇前期孕婦外周血微囊泡也能表達(dá)合體滋養(yǎng)細(xì)胞特異性標(biāo)記物,少部分表達(dá)血小板、紅細(xì)胞、白細(xì)胞標(biāo)志物和基本不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物;4)Nanosight結(jié)果顯示兩組制備的微囊泡的粒徑范圍大都在100-500nm之間;5)促凝實(shí)驗(yàn)中,與PBS溶劑對(duì)照組相比,胎盤研磨法pcMVs和子癇前期孕婦外周血微囊泡組的凝血酶原時(shí)間(Prothrombin time,PT)均明顯縮短(p0.001),顯示兩組制備的微囊泡均具有促凝活性,而與外周血微囊泡組相比,胎盤研磨法pcMVs的PT值明顯縮短(p0.001);6)兩組微囊泡均能穿透HUVEC,并且研磨法pcMVs穿透能力高于外周血微囊泡;7)胎盤pcMVs能破壞HUVEC之間的連接,增大細(xì)胞間的縫隙,并且引起內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)改變,細(xì)胞高度明顯增加;外周血微囊泡也能破壞細(xì)胞連接,使內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。結(jié)論:1)通過胎盤絨毛組織研磨分步離心的方法在體外成功大量制備了微囊泡,具有完整的膜結(jié)構(gòu)、能高表達(dá)滋養(yǎng)細(xì)胞特異性標(biāo)記物并且直徑大小范圍符合微囊泡定義,并且與子癇前期外周血微囊泡形態(tài)特征相符合;2)體外利用研磨法制備的胎盤pcMVs具有促凝活性,并且會(huì)引起內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加,損害內(nèi)皮細(xì)胞等功能活性,為后續(xù)研究pcMVs與子癇前期發(fā)病機(jī)制相關(guān)性提供了充足的原料。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R714.244
【部分圖文】：

(1) 將離心所得研磨法 pcMVs 和外周血微囊泡的重懸液分別稀釋 50 倍和 20 倍充分混勻后使用 1ml 無菌注射器導(dǎo)入納米顆粒分析儀中，在屏幕上觀察布朗運(yùn)動(dòng)。(2) 之后可在納米顆粒分析儀的屏幕上觀察到微囊泡的布朗運(yùn)動(dòng)，然后對(duì)其結(jié)果直接進(jìn)行分析。1.1.6.2 實(shí)驗(yàn)原理NanoSight 納米顆粒分析儀主要運(yùn)用光散射的原理和微囊泡的布朗運(yùn)動(dòng)，反映所測(cè)樣本液體中微囊泡。當(dāng)激光束照射到微囊泡表面時(shí)，就會(huì)使激光束發(fā)生散射，然后通過顯微鏡清晰地觀察到囊泡，并且可用顯微鏡記錄下微囊泡的布朗運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而分析所測(cè)微囊泡樣本液的粒徑分布曲線。1.2 結(jié)果1.2.1 免疫組織化學(xué)法鑒定選取樣本組織選取樣本組織的陽性組能大量表達(dá) PLAP（圖 1A），證明選取的組織包含有合體滋養(yǎng)細(xì)胞；PBS 溶劑空白對(duì)照組則不表達(dá)（圖 1B）。

于 0.1μm 的區(qū)域，用來確定微囊泡的大小以及位置(圖 2.1A)。其中圖 2.1.B 所示 P1 區(qū)域即為微囊泡的區(qū)域，橫縱坐標(biāo) FSC 和 SSC 均采用對(duì)數(shù)刻度。選定 P1門，進(jìn)入下一個(gè)散點(diǎn)圖（圖 2.1C），橫坐標(biāo)為 PE 熒光素結(jié)合的 PS 的標(biāo)記 AnnexinV，縱坐標(biāo)為 FITC 熒光素結(jié)合的合體滋養(yǎng)細(xì)胞的標(biāo)記物 PLAP，橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)均采用對(duì)數(shù)刻度。最后應(yīng)用購買的 AccuCount Ultra-Rainbow FluorescebntParticles（濃度 beads），根據(jù)濃度濃度 beads 在 FSC/PerCP 散點(diǎn)圖（圖 2.1D）生成的圖形，來圈定濃度微粒的位置，根據(jù)公式（收集微囊泡總數(shù)*500）/（收集濃度 beads 數(shù)*樣本體積）=樣品微囊泡的濃度（個(gè)/μl），計(jì)算所測(cè)微囊泡的濃度。胎盤研磨法 pcMVs 測(cè)定的流式管中，根據(jù) FITC-PLAP 的同型對(duì)照和PE-Annexin V+EDTA 對(duì)照管（圖 2.2B）劃定 FITC-PLAP 陽性的區(qū)域（Q1-1+Q2-1象限）和 PE-Annexin V 陽性區(qū)域（Q4-1+Q2-1 象限），圖 2.2C 中 Q2-1 象限則為FITC-PLAP 和 PE-Annexin V 雙陽性區(qū)域。子癇前期孕婦外周血微囊泡測(cè)定的流式管中，圖 2.2Ⅱ?yàn)?PLAP 的同型對(duì)照和 PE-Annexin V+EDTA 對(duì)照管，圖 2.2C中 Q2-1 象限也是 FITC-PLAP 和 PE-Annexin V 雙陽性區(qū)域。

圖 1.2.2 A 和Ⅰ：胎盤研磨法 pcMVs 組和子癇前期孕婦外周血微囊泡組的陰性對(duì)照管；B 和Ⅱ：胎盤研磨法 pcMVs 和子癇前期孕婦外周血微囊泡FITC-PLAP 的同型對(duì)照；C 和Ⅲ：胎盤研磨法 pcMVs 和子癇前期孕婦外周血微囊泡 FITC-PLAP/PE-Annexin V 陽性區(qū)域 Q2-1按照 P2 區(qū)域， 1g 胎盤絨毛組織研磨離心 1ml PBS 重懸然后稀釋 10 倍，按照低速 60s 上機(jī)所得的微囊泡濃度為 2-4*106個(gè)/μl，而 20ml 子癇前期孕婦外周血超離 200μl 重懸后，同樣按照低速 60s 上機(jī)所測(cè)得微囊泡的濃度為 1-4*106個(gè)/μl。我們對(duì)比研磨法 pcMVs 組和外周血微囊泡組 FITC-PLAP 陽性率，結(jié)果顯示胎盤研磨法 pcMVs 的 FITC-PLAP 陽性率為 88.6%±2.4%，外周血微囊泡FITC-PLAP 陽性率為 57.3%±2.1%，胎盤研磨法 pcMVs 組和外周血微囊泡組PE-Annexin V 陽性率分別為 4.2%±0.8%、 3.3%±1.2%。1.2.2.2 研磨法 pcMVs 和外周血微囊泡兩組中血小板、紅細(xì)胞、白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)
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