發(fā)布時間：2018-05-30 11:50

  本文選題：谷丙轉(zhuǎn)氨酶 + 非酒精性脂肪肝��； 參考：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：第一章 第一部分 影響廣西防城港地區(qū)男性人群谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平的流行病學(xué)因素及其相互作用分析 目的：在普通人群中，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)升高通常提示顯著的或者潛在的肝臟疾病，甚至會累計對全身健康造成威脅。因此，基于廣西防城港地區(qū)男性人群健康調(diào)查（The Fangchenggang AreaMale Healthy and Examination Survey, FAMHES）的結(jié)果，我們評估了影響該地區(qū)成年男性人群血清中ALT水平的流行病學(xué)因素以及他們之間的相互作用。 方法：在4304例受試者中，我們總共納入了2119例在2009年9月至2009年12月完成了完整的體格檢查，實驗室檢查，肝臟超聲檢查以及調(diào)查問卷的符合納入標準的受試者數(shù)據(jù)。 結(jié)果：在納入人群中，非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liverdisease, NAFLD）和代謝綜合征（metabolic syndrome, MetS）的患病率顯著相關(guān)于ALT水平的升高（P 0.05）。NAFLD和MetS的患病率密切相關(guān)（r=0.991，P=0.009）不正常的MetS各組分比例隨著ALT水平的升高成比例的明顯增加（P 0.01）。在隨后進行的多元線性回歸分析中，腹部肥胖指標體重指數(shù)（body mass index, BMI）和高脂血癥和ALT水平顯著相關(guān)（P 0.01）。在乙肝表面抗原（hepatitis B virus surface antigen, HBsAg）和MetS的交互作用研究中，我們并未發(fā)現(xiàn)其對于ALT水平有明顯交互作用。HBsAg和MetS之間對ALT影響的協(xié)同作用系數(shù)(synergy index,SI)為0.74，95%可信區(qū)間（confidence interval, CI）:0.71-0.80。 結(jié)論：在防城港地區(qū)男性人群中，NAFLD和MetS的患病率顯著相關(guān)于ALT水平。腹部肥胖和高脂血癥是導(dǎo)致ALT水平升高的獨立危險因素。這一發(fā)現(xiàn)提示在這一地區(qū)男性人群中，有必要在檢測ALT水平的過程中校正這些可能導(dǎo)致ALT水平升高的危險因素。 第一章 第二部分 針對前瞻性研究的循證醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平升高顯著相關(guān)于代謝綜合征的發(fā)生 目的：代謝綜合征（metabolic syndrome, MetS）的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)顯著升高且與谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase,ALT）活動水平緊密聯(lián)系。但是，ALT活動水平對MetS發(fā)生率的影響在已發(fā)表文獻中的報道并不一致。因此，我們針對前瞻性隊列研究通過薈萃分析的方法估算了ALT活動水平升高和MetS發(fā)生率之間的關(guān)系。 方法：收集所有已發(fā)表在Pubmed, Embase,和ISI數(shù)據(jù)庫中的研究ALT活動水平和MetS發(fā)生率之間關(guān)系的前瞻性隊列研究（文獻發(fā)表在2014年1月10日之前）。包括研究的國別，性別組成，納入人群的年齡，隨訪時間，MetS定義，校正因素，相對危險度（relative risk,RR）等具體指標直接或間接從最終納入文獻中提取或計算。我們將分別估計二分類變量的合并RR值及其95%可信區(qū)間（confidence interval, CI）（RR定義為高ALT水平組人群MetS發(fā)生率/低ALT水平組人群MetS發(fā)生率）和連續(xù)變量的合并RR值及95%CI(RR定義為ALT水平每升高5單位每升[unit perliter,U/l]人群中MetS發(fā)生率變化的比值)。如果組間異質(zhì)性不明顯（P值0.05以及I250%）,在計算合并RR值的過程中則采用固定效應(yīng)模型；如果組間有顯著的差異性(P值≤0.05或I2≥50%)，則采用隨機效應(yīng)模型。 結(jié)果：總共七篇前瞻性隊列研究，包含了31545例受試者和2873例在隨訪期間發(fā)生MetS的病例被納入本次研究。在比較高值A(chǔ)LT水平和低值A(chǔ)LT水平人群MetS發(fā)生率的差異中，合并估計的RR值為1.81(95%CI:1.49-2.14)。而在劑量-反應(yīng)計算估計ALT水平每升高5U/l導(dǎo)致人群MetS發(fā)生率的變化中，合并估計的RR值為1.13（95%CI:1.11-1.16）。亞組分析發(fā)現(xiàn)性別差異可能是整個研究中異質(zhì)性的主要來源。在以性別為標準的亞組分析中，亞組之間劑量-反應(yīng)(每5U/l)估算的合并RR值比較P=0.007。女性有比男性更高的劑量反應(yīng)RR（1.38,95%CI:1.20-1.55）。進一步的，敏感度分析證實了結(jié)果的可靠性。本次薈萃分析并未發(fā)現(xiàn)顯著的發(fā)表偏倚。 結(jié)論：目前基于前瞻性研究的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)支持ALT水平升高增加MetS發(fā)生風險的觀點。且這種關(guān)聯(lián)在女性人群中表現(xiàn)得更加緊密，一致性更好。這一關(guān)系有待更多的研究證實。同時ALT水平升高對MetS發(fā)生的潛在機制研究也有待進一步探索。 第二章 全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)新的影響廣西防城港地區(qū)男性人群中血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平的單核苷酸多態(tài)性位點及其生物信息學(xué)意義分析 目的：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase, ALT）是評估肝臟疾病和全身健康的重要的生物標志物。ALT水平受到環(huán)境因素和遺傳因素的共同影響。因此我們實施了一項全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wideassociation studies，GWAS），結(jié)合前期防城港地區(qū)男性健康調(diào)查（Fangchenggang Area Male Healthy and Examination Survey,FAMHES）結(jié)果，找出影響防城港地區(qū)男性健康人群的ALT水平的常見遺傳學(xué)變異及其與環(huán)境因素的交互作用。 方法：采集研究人群的外周靜脈血檢測血清提取脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）樣本。在前期FAMHES納入的人群中，總共1999例健康男性的外周血樣進行全基因組單核苷酸多態(tài)性（SingleNucleotide Polymorphisms,SNPs）檢測，平臺為Illumina Omni One。在全基因組SNPs分型的基礎(chǔ)之上，采用校正了年齡，體重指數(shù)（body massindex, BMI）,甘油三酯（triglycerides,TG）變量的多元線性回歸模型，尋找可能影響該地區(qū)男性人群ALT水平的常見遺傳變異標志。進一步地，全基因組關(guān)聯(lián)分析在以乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）為分類標準的亞組中進行比較。全基因組關(guān)聯(lián)分析統(tǒng)計學(xué)檢驗顯著性水平的檢驗標準為P1*10 5,在乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）陽性人群中的統(tǒng)計學(xué)檢驗顯著性水平的檢驗標準為P0.05�；蚍中偷馁|(zhì)量控制標準：滿足哈 溫平衡（Hardy Weinberg Equilibrium，HWE檢驗P＞0.001）;最小等位基因頻率0.01；基因分型成功率(call rate)＞0.95。采用非參數(shù)檢驗（Mann Whitney Test）的方法比較以HBsAg和MetS分類的亞組中不同SNP基因型之間的ALT值。最后，采用交互作用的流行病學(xué)模型，結(jié)合潛在遺傳變異和常見的影響ALT水平的表型因素（包括代謝綜合征[metabolic syndrome, MetS]和乙肝病毒[hepatitis B virus, HBV]感染）,評估遺傳變異和表型因素之間的交互作用。 結(jié)果：本次GWAS總共發(fā)現(xiàn)位于5個基因區(qū)域的7個SNPs經(jīng)全基因組關(guān)聯(lián)分析統(tǒng)計學(xué)檢驗后，顯著性水平P1*10-5,包括：位于SLC35F3基因1q42.2上的rs10157061(P=7.46*10-7),rs10752781(P=1.29*10-6),rs1878544(P=2.16*10-6)；位于CUX2基因12q24.12上的rs4766453(P=1.11*10-6)；位于SHANK1基因19q13.3上的rs4801847(P=3.26*10-6)；位于WWOX基因上16q23.3上的rs2010020(P=7.73*10-6)；位于CYP1A2基因15q24.1的rs3743484(P=8.20*10-6)。其中位于2個基因區(qū)域的4個SNPs(位于SLC35F3基因1q42.2上的rs10157061,rs10752781,rs1878544；位于CUX2基因12q24.12上的rs4766453)經(jīng)全基因組關(guān)聯(lián)分析統(tǒng)計學(xué)檢驗后顯著性水平P3*10-6。在HBsAg陽性人群中，位于SLC35F3基因1q42.2上的rs10157061,rs10752781,rs1878544；位于WWOX基因上16q23.3上的rs2010020；位于CYP1A2基因15q24.1的rs3743484同時達到在HBsAg陽性人群中的統(tǒng)計學(xué)效力（P0.05）。在結(jié)合SNP基因型和MetS，HBsAg表型分組的的亞組分析中，各亞組間人群ALT值仍然SNP基因型的變化而有所差異(P0.05)。我們發(fā)現(xiàn)潛在意義較大(P3*10-6)的候選SNPs（包括位于SLC35F3基因1q42.2上的rs10157061, rs10752781, rs1878544；位于CUX2基因12q24.12上的rs4766453）和陽性HBsAg之間對ALT水平的影響的協(xié)同效應(yīng)系數(shù)[synergy index, SI]及其95%可行區(qū)間（confidenceinterval，CI）均大于1。 結(jié)論：因此，一項針對防城港地區(qū)成年男性人群的GWAS發(fā)現(xiàn)了新的影響人群血清中ALT水平的常見遺傳變異標記。其中SLC35F3和CUX2可能是影響該地區(qū)成年男性血清ALT水平的易感基因。但是這種效應(yīng)可能因為人群的肝炎病毒感染背景不同而有所不同。SNPs對人群ALT水平的影響可能會在HBV感染的背景下擴大。候選SNPs及其所在基因區(qū)域為個體化醫(yī)學(xué)診斷和治療提供了潛在的遺傳學(xué)標記。同時為下一步的驗證ALT水平的遺傳學(xué)機制提供了有意義的靶點。潛在SNPs及其所在基因區(qū)域?qū)LT水平的影響機制有待進一步研究證實。 第三章 第一部分 全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)的新的影響防城港地區(qū)男性人群血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平的單核苷酸多態(tài)性位點在永生化肝細胞株中的驗證 目的：基于前期針對防城港地區(qū)男性健康調(diào)查（Fangchenggang AreaMale Healthy and Examination Survey,FAMHES）人群全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study,GWAS）的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)了新的影響防城港地區(qū)健康男性血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase, ALT）水平的單核苷酸多態(tài)性位點（single nucleotide polymorphisms,SNPs）。但是GWAS發(fā)現(xiàn)的SNPs與表型特征之間可能存在假關(guān)聯(lián)。因此，我們選取永生化肝細胞株為研究對象其中候選SNPs與其上清液ALT水平之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系。同時對SNPs坐落的基因，GPT基因（肝臟ALT編碼基因）及其編碼蛋白表達水平進行檢測，在細胞株層面探討候選SNPs坐落基因及其編碼蛋白的表達水平與GPT基因及編碼蛋白表達水平及各細胞株表型（即各細胞株上清液ALT水平）之間存在的關(guān)系。 方法：選取BEL-7402，BEL-7404，HL-7702，SMMC-7721，Hep-G2，MHCC-97H,MHCC-97L共7株永生化肝細胞株作為研究對象，通過細胞培養(yǎng)繁殖，消化貼壁細胞后提取細胞用做以下實驗：1.提取細胞脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），，針對目的SNPs設(shè)計普通聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）引物,通過PCR反應(yīng)獲得擴增產(chǎn)物。產(chǎn)物以sanger雙向測序法獲得目的SNPs（左右約50個堿基對[base-pairs,BP]）片段序列,從而獲得目的SNPs的基因型結(jié)果；2.提取細胞株上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immuno sorbentassay，elisa）的方法獲取各細胞株上清液ALT值；3.針對候選SNPs坐落基因，設(shè)計特異性實時熒光定量PCR（real-time PCR）引物,檢測不同基因型的肝細胞株間目的基因和ALT基因的表達情況；4.提取細胞的總蛋白，設(shè)計針對目的基因編碼蛋白的特異性抗體，采用蛋白印跡（western-blot）的方法觀察特異蛋白的表達情況；4.將消化細胞接種到無菌玻璃片上，采用特異性抗體免疫組化（Immunohistochemistry，IHC）的方法觀察各特異蛋白在不同細胞株中的表達部位以及表達量變化。 細胞實驗均采取三次重復(fù)，計量指標采用平均值±標準差（mean±standard deviation [SD]）表示。各細胞株間上清液ALT值，目的基因表達量及目的蛋白表達量之間比較采用非參數(shù)檢驗Mann-Whitney U檢驗的方法進行。表達量相關(guān)性比較采用pearson相關(guān)系數(shù)計算。P0.05被認為有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)果：總共7個永生化肝細胞株中，在其中3個基因區(qū)域的5個SNPs上表現(xiàn)出多態(tài)性，所有候選SNPs在細胞株中均表現(xiàn)為純合子。7個細胞株按照其攜帶的不同SNPs的高值等位基因數(shù)目分布的不同分為3組：其中A組細胞株MHCC-97H和MHCC-97L在位于SLC35F3基因1q42.2區(qū)域上的rs10157061,rs10752781, rs1878544；位于CUX2基因12q24.12區(qū)域上的rs4766453；位于SHANK1基因19q13.3上的rs4801847共5個SNPs上均攜帶高值等位基因，B組細胞株SMMC-7721在位于SHANK1基因上的rs4801847SNP上攜帶高值等位基因，C組細胞株（包括BEL-7402，BEL-7404，HepG2，HL-7702）在總共位于5個基因區(qū)域的7個SNPs上均攜帶低值等位基因。經(jīng)比較，A組MHCC-97H和MHCC-97L細胞株在上清液ALT值顯著高于其他各組細胞株ALT值，B組SMMC-7721細胞株與C組細胞株間上清液ALT值差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。實時熒光定量PCR的結(jié)果提示A組GPT基因表達水平高于B組，C組，但SLC35F3的表達水平和GPT基因表達水平呈現(xiàn)顯著負相關(guān)（r2=-0.672，P=0.001），CUX2的表達水平在不同基因型分組中，組間表達差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P0.05）。實時熒光定量PCR結(jié)果得到了蛋白印跡和免疫組化結(jié)果的印證。在蛋白印跡實驗中，A組SLC35F3編碼蛋白表達水平顯著低于B組，C組，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性（P0.05）。A組GPT編碼蛋白表達水平顯著高于B組，C組，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性（P0.05）。CUX2編碼蛋白組間表達無統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05）。各組間SLC35F3和GPT蛋白表達水平存在明顯負相關(guān)（r=-0.527， P=0.002）。免疫組化實驗印證了蛋白印跡結(jié)果。 結(jié)論：基于FAMHES的GWAS研究中發(fā)現(xiàn)的影響男性人群血清ALT水平的SNPs，我們結(jié)合體外細胞學(xué)驗證得出：1.位于SLC35F3基因1q42.2上的顯著影響人群血清ALT水平的候選SNPs（包括rs10157061，rs10152781,rs1878544）同時顯著影響SLC35F3基因和蛋白表達水平。高值等位基因?qū)?yīng)SLC35F3基因和編碼蛋白的低表達。2. SLC35F3基因可能是影響肝細胞ALT分泌水平的易感基因。SLC35F3的基因和編碼蛋白的表達水平的上調(diào)與GPT基因的低表達及細胞ALT的低水平相關(guān)。位于1q42.2上的強連鎖不平衡區(qū)域的rs10157061，rs10152781,rs1878544可能通過影響SLC35F3的基因和蛋白表達水平間接地影響和調(diào)控了肝細胞ALT水平。相關(guān)機制有待進一步研究證實。 第三章 第二部分 低濃度乙醇暴露下永生化肝細胞株MHCC-97H和BEL7402中SLC35F3基因表達研究 背景和目的：基于前期細胞株驗證的初步結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)SLC35F3基因可能對體外永生化肝細胞株中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvictransamine GPT）基因表達水平，上清液谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanineaminotransferase,ALT）水平存在影響。SLC35F3基因及其編碼蛋白的低表達關(guān)聯(lián)于GPT基因的高表達和ALT值的升高。但永生化肝細胞株在外界環(huán)境壓力下，SLC35F3和GPT的表達情況仍不得而知。因此，我們設(shè)計了低濃度乙醇干預(yù)實驗，觀察體外永生化肝細胞株SLC35F3，GPT基因及其編碼蛋白表達情況，及其相互關(guān)系。 方法：選取永生化肝細胞株BEL-7402和MHCC-97H作為研究對象。分別以50mmol/l,100mmol/l,和200mmol/l的乙醇濃度干預(yù)永生化肝細胞株，并觀察永生化肝細胞株在3小時，6小時，12小時，24小時不同時間節(jié)點的ALT分泌值，SLC35F3，GPT基因及其編碼蛋白表達值 選取BEL-7402，MHCC-97H兩株永生化肝細胞株作為研究對象，通過細胞培養(yǎng)繁殖，消化吹散后均勻接種于24孔板中，貼壁后觀察細胞，分別以50mmol/l,100mmol/l,和200mmol/l的乙醇濃度干預(yù)永生化肝細胞株，并觀察永生化肝細胞株在3小時，6小時，12小時，24小時不同時間節(jié)點對永生化肝細胞株進行以下處理：1.提取細胞株上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immuno sorbent assay，elisa）的方法獲取各細胞株上清液ALT值；2.針對SLC35F3和GPT基因，設(shè)計特異性實時熒光定量PCR（real-time PCR）引物,檢測不同細胞株不同時間-濃度乙醇干預(yù)水平下SLC35F3和GPT基因表達水平；3.提取細胞株在不同時間-濃度乙醇干預(yù)水平下細胞的總蛋白，設(shè)計針對SLC35F3和GPT基因編碼蛋白的特異性抗體，采用蛋白印跡（western-blot，WB）的方法觀察特異蛋白的表達情況；4.將不同時間-濃度乙醇干預(yù)水平下的細胞消化后，接種到無菌玻璃片上，采用特異性抗體免疫組化（Immunohistochemistry，IHC）的方法觀察各SLC35F3和GPT特異蛋白在不同細胞株中的表達部位以及表達量變化。 細胞實驗均采取三次重復(fù)，計量指標采用平均值±標準差（mean±standard deviation [SD]）表示。組間比較統(tǒng)計學(xué)方法使用遵循以下原則：如數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，則比較選用方差分析（one-way ANOVA）;如數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則比較選用非參數(shù)檢驗（Mann-Whitney U test）。除非特殊說明，P0.05被認為是有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)果：我們檢測了不同時間-濃度乙醇干預(yù)濃度下BEL-7402和MHCC-97H兩株細胞的上清液分泌值，SLC35F3，GPT兩基因表達，編碼蛋白表達情況。具體結(jié)果如下：1. BEL-7402ALT達峰時間穩(wěn)定在6小時，而MHCC-97H ALT達峰時間由100mmol/l乙醇干預(yù)下的12小時，縮短至200mmol/l乙醇干預(yù)下的3小時。不同濃度酒精干預(yù)下，BEL-7402的ALT峰值水平差別無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P0.05），MHCC-97H的ALT峰值水平隨著乙醇干預(yù)濃度的加大而升高，差別有統(tǒng)計學(xué)顯著性（P0.05）；2.不同時間-濃度乙醇干預(yù)下BEL-7402和MHCC-97H的SLC35F3及GPT基因表達水平存在差異。BEL-7402的SLC35F3基因和GPT基因分別在12小時和6小時達到峰值，相對穩(wěn)定，且隨乙醇暴露濃度的增加峰值水平變化不大,差別無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P0.05）。而MHCC-97H的SLC35F3基因和GPT基因表達水平的達峰時間和峰值表達水平隨著不同干預(yù)濃度的變化較大，其達峰時間從50mmol/l乙醇暴露下的24小時，提前到200mmol/l乙醇暴露下的3小時。峰值水平隨著乙醇暴露濃度的升高而升高，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性（P0.05）。3.蛋白印跡半定量結(jié)果顯示：BEL-7402SLC35F3和GPT基因編碼蛋白表達達峰時間穩(wěn)定在12小時和6小時，而MHCC-97H SLC35F3和GPT基因編碼蛋白表達達峰時間隨著乙醇暴露濃度的增加而提前，由200mmol/l乙醇暴露下SLC35F3和GPT編碼蛋白表達水平高于相應(yīng)的50mmol/l和100mmol/l乙醇干預(yù)濃度下的表達水平（P0.05）。免疫組化結(jié)果與蛋白印跡觀察結(jié)果一致。 結(jié)論：在應(yīng)激環(huán)境下，基礎(chǔ)高表達SLC35F3基因的BEL-7402表現(xiàn)出在體外環(huán)境下表現(xiàn)出比低表達SLC35F3基因的MHCC-97H細胞株更強的自身穩(wěn)定性和對乙醇的低度易感性，及其更小的損傷。SLC35F3基因的基礎(chǔ)表達水平可能與乙醇干預(yù)下肝細胞自身調(diào)節(jié)及ALT代謝機制有關(guān)。在基礎(chǔ)狀態(tài)下SLC35F3基因的高表達有利于在應(yīng)對乙醇刺激時，降低乙醇損傷的易感性，減輕乙醇所致的肝臟損傷。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R575.5;R589

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 董榮春,周榮華,呂發(fā)度,陶文照;SMMC-7721人體肝癌細胞株的建立及其生物學(xué)特性的初步觀察[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;1980年01期

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本文編號：1955200