發(fā)布時間：2020-12-02 22:23

　　丙型肝炎（Hepatitis C Virus, HCV）是一個全球性危害人類健康的重要病原體,感染后機體極易導(dǎo)致慢性肝炎,并引起肝纖維化、肝硬化、肝壞死,最終導(dǎo)致肝癌。目前對于丙型肝炎病毒致病機制的了解仍舊非常有限。研究發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒的致病性除了病毒本身因素外,病毒蛋白與宿主細胞蛋白的相互作用在其中發(fā)揮重要的作用。在組成病毒的結(jié)構(gòu)蛋白（Struotural Protein）口非結(jié)構(gòu)蛋白中,非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A通過與細胞蛋白的相互作用在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運、抗細胞凋亡以及其它的一些方面發(fā)揮了重要作用,研究表明在HCV病毒感染宿主細胞后,在細胞內(nèi)裝配。其中NS5A中的dmainⅡ domainⅢ區(qū)域也影響了HCV的復(fù)制,并且許多相互作用的后果都能維持或促進病毒在細胞內(nèi)的持續(xù)復(fù)制,但其詳細機制有待進一步明確。我們通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選人類肝臟cDNA文庫時得知domainⅡ-Ⅲ與USF2之間有可能存在相互作用,鑒于這兩種蛋白質(zhì)在細胞生理功能上的重要性,我們對其相互作用做了進一步的驗證,通過GST融合蛋白沉降技術(shù)、免疫共沉淀技術(shù)的結(jié)果不能證明NS5A domainⅡ-Ⅲ與USF2之間一定存在... 

【文章來源】：湖北大學(xué)湖北省

【文章頁數(shù)】：60 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 文獻綜述
    1.1 丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A的研究背景
        1.1.1 丙型肝炎病毒介紹
            1.1.1.1 丙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)和特點
            1.1.1.2 HCV病毒在肝細胞的復(fù)制過程
            1.1.1.3 HCV基因組結(jié)構(gòu)
        1.1.2 NS5A基因的結(jié)構(gòu)和定位
        1.1.3 NS5A功能與作用
    1.2 USF概述
        1.2.1 USF2的結(jié)構(gòu)
        1.2.2 USF2的功能與疾病發(fā)生
            1.2.2.1 USF2的自我剪切
            1.2.2.2 USF2與細胞增殖
            1.2.2.3 USF2與糖脂代謝
            1.2.2.4 USF2與腎臟疾病
    1.3 蛋白質(zhì)相互作用
        1.3.1 研究蛋白質(zhì)相互作用的意義
        1.3.2 研究蛋白質(zhì)相互作用的方法
            1.3.2.1 酵母雙雜交系統(tǒng)（yeast two-hybrid system,Y2H system）
            1.3.2.2 GST融合蛋白沉降（GST Pull-Down）技術(shù)
            1.3.2.3 免疫共沉淀（immunoprecipation）
    1.4 研究目的
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株、細胞系和質(zhì)粒
            2.1.1.1 菌株
            2.1.1.2 細胞系
            2.1.1.3 質(zhì)粒
        2.1.2 培養(yǎng)基
        2.1.3 試劑和酶
        2.1.4 主要緩沖液
        2.1.5 儀器和設(shè)備
    2.2 方法
        2.2.1 引物序列
        2.2.2 基因擴增體系
        2.2.3 基因擴增條件
        2.2.4 大腸桿菌高效率感受態(tài)細胞制備
        2.2.5 大腸桿菌的快速轉(zhuǎn)化
        2.2.6 大腸桿菌的常規(guī)轉(zhuǎn)化
        2.2.7 質(zhì)粒DNA的提取與純化
            2.2.7.1 堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA
            2.2.7.2 商業(yè)化試劑盒抽提質(zhì)粒DNA
        2.2.8 質(zhì)粒酶切
        2.2.9 SDS-PAGE檢測表達蛋白
        2.2.10 免疫印記檢測表達蛋白
        2.2.11 HEK293細胞的復(fù)蘇
        2.2.12 HEK293細胞的凍存
        2.2.13 哺乳動物細胞系HEK293的組織培養(yǎng)
        2.2.14 哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)染
        2.2.15 應(yīng)用酵母雙雜交篩選人類肝臟有限cDNA文庫的步驟
            2.2.15.1 有限5×cDNA文庫的制備
            2.2.15.2 酵母菌的質(zhì)粒DNA的小量轉(zhuǎn)化
            2.2.15.3 酵母菌的人類肝臟cDNA文庫轉(zhuǎn)化
            2.2.15.4 啤酒酵母中質(zhì)粒DNA的抽提
            2.2.15.5 一步法轉(zhuǎn)化酵母
            2.2.15.6 酵母大平板的影印
            2.2.15.7 酵母LacZ顯色
        2.2.16 GST pull down步驟
        2.2.17 免疫共沉淀步驟
3 結(jié)果與分析
    3.1 酵母雙雜交結(jié)果
        3.1.1 NS5A domainⅡ-Ⅲ和Ⅲ自身激活作用的檢測
        3.1.2 以NS5A domainⅡ-Ⅲ和Ⅲ為“誘餌”的篩庫結(jié)果
        3.1.3 Blast序列比對結(jié)果
        3.1.4 在二缺平板SC-Leu-Trp篩選結(jié)果
        3.1.5 酵母LacZ顯色結(jié)果
    3.2 NS5AdomainⅡ-Ⅲ,Ⅲ和USF2全長基因的擴增
    3.3 GST-pulldown結(jié)果
        3.3.1 NS5AdomainⅡ-Ⅲ和Ⅲ與USF2的相互作用對GST-pull down重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.2 NS5AdomainⅡ-Ⅲ,Ⅲ與USF2的原核表達純化結(jié)果
        3.3.3 GST-pull down
    3.4 免疫共沉淀驗證NS5A與USF2之間的相互作用
4 討論與展望
    4.1 討論
        4.1.1 HCV NS5A domainⅡ-Ⅲ與USF2的相互作用
        4.1.2 HCV NS5A domainⅡ-Ⅲ與USF2相互作用的生理意義
    4.2 展望
參考文獻
致謝



本文編號：2895659