發(fā)布時間：2020-11-21 18:28

　　 肝素(heparin,HP)是由葡萄糖醛酸(glucuronic acid,GlcA)或艾杜糖醛酸(iduronic acid,IdoA)與葡萄糖胺(glucosamine,GlcN)構(gòu)成的二糖單元組成的一種糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG),其中二糖單元的不同位點存在不同程度的硫酸化修飾,導致肝素結(jié)構(gòu)十分復雜。肝素是臨床上重要的抗凝藥物,臨床實踐還發(fā)現(xiàn)肝素能明顯延長癌癥患者的生存期,藥理活性研究進一步證明肝素及其衍生物在動物體內(nèi)具有顯著的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用,其主要機制是阻斷腫瘤細胞黏附、抑制新生血管生成等。但動物源肝素存在較大的安全隱患,而且化學法脫硫酸化、乙�；�修飾可能導致肝素衍生物的工藝可靠性差、結(jié)構(gòu)更為復雜。因此,迫切需要發(fā)展一種更加安全、可靠的制備肝素及其衍生物的新方法。大腸桿菌K5(Escherichia coli K5)產(chǎn)生的莢膜多糖是一種非硫酸化的GAG,二糖重復單元由GlcA與乙酰葡萄糖胺(acetyl glucosamine,GlcNAc)組成,因而被稱為肝素前體(heparosan或N-acetylheparosan,NAH)。本課題通過發(fā)酵大腸桿菌K5制備肝素前體heparosan;然后采用化學處理與酶催化反應相結(jié)合的策略對其進行選擇性修飾,以合成不同硫酸化修飾模式的肝素衍生物;最后測定得到的五種肝素衍生物體外對腫瘤細胞黏附人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的影響,揭示肝素衍生物抑制腫瘤細胞黏附的構(gòu)效關系,為研究非動物源抗腫瘤肝素類創(chuàng)新藥物提供參考依據(jù)。本學位論文取得的成果及結(jié)論包括以下幾個方面:1.Heparosan多糖的制備與表征大腸桿菌K5在葡萄糖合成培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵18 h,發(fā)酵上清液經(jīng)超濾濃縮、醇沉得胞外多糖粗品,粗品經(jīng)強陰離子交換柱層析純化得多糖精品,以每升發(fā)酵液制備的多糖純品計,產(chǎn)量為105 mg/L。雙糖分析與核磁共振(NMR)測試表明制備的細菌胞外多糖的結(jié)構(gòu)與肝素前體heparosan相同;凝膠滲透色譜(GPC)分析表明heparosan的純度為98.2%,分子量為69.22 kDa,制備規(guī)模達到克級。2.非動物源肝素衍生物的制備與結(jié)構(gòu)表征Heparosan在堿性條件下徹底N-脫乙�；�,其后以三氧化硫-三甲胺復合物為硫酸基供體進行N-硫酸化(NS)修飾得到含N-硫酸化葡萄糖胺(GlcNS)的肝素衍生物(命名為NS-NAH),其肝素酶完全水解產(chǎn)物的雙糖分析確定不飽和雙糖△U-GlcNS的比例為97.9%,說明絕大多數(shù)GlcNAc被修飾為GlcNS。在C5異構(gòu)化酶(Cs-epi)和2-O-硫酸基轉(zhuǎn)移酶(2-OST)的共同催化下,NS-NAH的GlcA殘基一步轉(zhuǎn)變?yōu)?-O-硫酸化艾杜糖醛酸(IdoA2S),經(jīng)QSepharose強陰離子交換柱層析純化得到含IdoA2S的肝素衍生物(命名為I2S-NS-NAH),雙糖分析證明其雙糖△U2S-GlcNAc、AU2S-GlcNS 的含量 0.7%、90.4%,表明 GlcA 的轉(zhuǎn)化率超過90%。在6-O硫酸基轉(zhuǎn)移酶1和6-O硫酸基轉(zhuǎn)移酶3(6-OST1/3)的催化下,I2S-NS-NAH 的 GlcN(GlcNS 及 GlcNAc)殘基被 6-O-硫酸化(6S),離子交換柱層析純化得到含GlcNS6S、GlcNAc6S的肝素衍生物(命名為6S-12S-NS-NAH),雙糖分析表明其雙糖 △U-GlcNAc6S、△U-GlcNS6S 和AU2S-GlcNS6S 的含量為 0.5%、13.5%、66.4%,表明 GlcN 的 6S 修飾率80%。NS-NAH經(jīng)6-OST1/3兩酶的催化修飾、離子交換柱層析純化得到另一種6S修飾的肝素衍生物(命名為6S-NS-NAH),雙糖分析確定其雙糖△U-GlcNAc6S、△U-GlcNS6S含量為0.4%、87.4%,表明GlcN的6S修飾率達87.8%。此外,將6S-I-2S-NS-NAH 溶于 0.5M NaOH 并于-20℃靜置 3d、凍干使 IdoA2S 發(fā)生 2-0-脫硫酸化,得到含IdoA的產(chǎn)物(命名為6S-I-NS-NAH),雙糖分析表明90.5%的IdoA2S發(fā)生2-0-脫硫酸化。NMR鑒定了五種肝素衍生物的結(jié)構(gòu)特征;GPC純度分析表明除6S-I-NS-NAH外,其余四種肝素衍生物的純度均達90%;衍生物的制備規(guī)模均達到百毫克級。3.肝素衍生物的抗凝活性及對腫瘤細胞黏附的影響運用抗FXa試劑盒測定heparosan及五種肝素衍生物的抗凝活性。實驗證實全部樣品的效價均不到對照品肝素鈉的1%,因此合成的產(chǎn)物為非抗凝肝素衍生物。參考文獻從新生兒臍帶中提取HUVECs并采用流式細胞技術進行鑒定。細胞毒性測定結(jié)果表明,濃度2000μg/ml的heparosan及五種肝素衍生物對HUVECs與腫瘤細胞均無明顯的細胞毒性(P0.05)。濃度為200μg/ml的五種肝素衍生物均對小鼠黑色素瘤細胞B16-F10展現(xiàn)出一定的細胞毒性(P0.05),而heparosan則不能;對于人乳腺癌細胞MDA-MB-231,只有6S-12S-NS-NAH、6S-I-NS-NAH展現(xiàn)出細胞毒性(P0.05);而對HUVECs,只有I2S-NS-NAH表現(xiàn)出一定細胞毒性(P0.05)。腫瘤細胞黏附HUVECs實驗證實,在測試的低、中、高三個濃度下(50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml),heparosan和NS-NAH均沒有表現(xiàn)出明顯的抗黏附作用;12S-NS-NAH在高濃度下能抑制B16-F10黏附HUVECs作用,而中、高濃度的6S-12S-NS-NAH、6S-I-NS-NAH、6S-NS-NAH均展現(xiàn)出抗黏附作用,對照品肝素鈉在低中高濃度下均展現(xiàn)出抗黏附作用。中濃度的6S-12S-NS-NAH具有明顯的抗黏附作用(P0.05),I2S-NS-NAH 則沒有(P0.05);6S-NS-NAH 在中、高濃度下均具明顯的抗黏附作用(P0.05),而NS-NAH均無作用(P0.05),因此,6-O-硫酸化對肝素衍生物的抗黏附作用是非常關鍵的。不同濃度的6S-I2S-NS-NAH與6S-I-NS-NAH相比,抗黏附作用沒有顯著差異(P0.05),提示IdoA的2-O-硫酸化對抗黏附作用沒有顯著影響。此外,6S-NS-NAH與6S-I-NS-NAH的抗黏附作用也沒有顯著差異(P0.05),二者主要區(qū)別在于糖醛酸的不同,說明GlcA與IdoA對肝素衍生物的抗黏附作用影響不大。與其他衍生物比較,以heparosan為原料合成肝素衍生物6S-NS-NAH的工藝簡單、產(chǎn)率高,值得進一步研究和開發(fā)。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R914;R96
【部分圖文】：

而后再培養(yǎng)１８－２４ｈ，發(fā)酵液離心并收集菌體沉淀，菌體于冰上超聲破碎，??離心，上清液過濾后用ＮｉＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ親和柱層析（１．５ｃｍ＞＜１５ｃｍ）進行純化，??上樣后先用Ａ液（２５ｍＭＴｒｉｓ、０．５ＭＮａＣｌ、３０ｍＭ咪唑，ｐＨ＝７．５）充分洗脫以??除去雜蛋白，然后再用Ｂ液（２５ｍＭＴｒｉｓ、０．５ＭＮａＣＩ、２５０ｍＭ咪唑，ｐＨ＝７．５）??洗脫目的蛋白，向目的蛋白溶液中加入１５％－２０％的甘油，－８０°Ｃ凍存?zhèn)溆谩??３．結(jié)果與分析??３．?１?Ｈｅｐａｒｏｓａｎ的提取與純化??發(fā)酵液經(jīng)醇沉得到的ｈｅｐａｒｏｓａｎ含有蛋白質(zhì)、色素、鹽等雜質(zhì)，為一種粗品。??運用Ｑ?Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ強陰離子交換柱純化可將ｈｅｐａｒｏｓａｎ與雜質(zhì)分離，如圖２－１，中??間只有２１０?ｎｍ吸收而沒有２６０?ｎｍ和２８０?ｎｍ吸收的峰即為ｈｅｐａｒｏｓａｎ的純化峰。??經(jīng)計算，以純化后凍干的ｈｅｐａｒｏｓａｎ純品計，每升發(fā)酵液產(chǎn)量約為１０５?ｍｇ。??３３Ｋ，??３３００－?＊??

３．?２?Ｈｅｐａｒｏｓａｎ?的表征??Ｈｅｐａｒｏｓａｎ經(jīng)肝素酶ｍ切割后進行ＨＰＬＣ分析，與肝素雙糖標準品的ＨＰＬＣ??圖譜（如圖２－２）比較，ｈｅｐａｒｏｓａｎ多糖全部被切成雙糖ＡＵ－ＧｌｃＮＡｃ?（如圖２－３），??這表明ｈｅｐａｒｏｓａｎ的雙糖重復單元為－ＧｌｃＡ－ＧｌｃＮＡｃ－。同時由Ｈｅｐａｒｏｓａｎ的１Ｈ?ＮＭＲ??圖譜可清楚看到ＧｌｃＮＡｃ的異頭氫（５５．２９）、Ｎ－乙酰基的氫信號峰（Ｓ１．９４）和??ＧｌｃＡ的異頭氫（５４．４０），如圖２－４。因此，發(fā)酵純化后制備的ｈｅｐａｒｏｓａｎ結(jié)構(gòu)特??征與文獻報道的結(jié)構(gòu)相符。ＧＰＣ分析結(jié)果顯示，１４．７?ｍｉｎ處出現(xiàn)單一對稱峰，如??圖２－５，因此經(jīng)醇沉與強陰離子交換柱層析純化后的ｈｅｐａｒｏｓａｎ純度達９８．１９％。??以多角度激光散射（ｍｕｌｔｉ－ａｎｇｌｅ?ｌａｓｅｒ?ｌｉｇｈｔ?ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ，?ＭＡＬＬＳ）測定?ｈｅｐａｒｏｓａｎ?的??重均分子量為６９．２２?ｋＤａ，多分散指數(shù)（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ?ｉｎｄｅｘ，ＰＤＩ）?１．５６，如圖??２－６?〇??０．０６－｜?６??Ｅ?３?５?８?１?ＡＵ－ＧＩｃＮＡｃ??１２?２?ＡＵ－ＧＩｃＮＳ??Ｃｇ?０．０４－?４?３?ＡＵ－ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ??苑?

圖２－６?Ｈｅｐａｒｏｓａｎ的多角度激光散射圖譜（見實驗記錄本ＩＩＩ－ｐｌｌ）??Ｆｉｇ．２－６?Ｍｕｌｔｉ－ａｎｇｌｅ?ｌａｓｅｒ?ｌｉｇｈｔ?ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ?ｓｐｅｃｔｒｕｍ?ｏｆ?ｈｅｐａｒｏｓａｎ??４討論??大腸桿菌Ｋ５經(jīng)搖瓶發(fā)酵，兩步純化得到ｈｅｐａｒｏｓａｎ，產(chǎn)量約１０５?ｍｇ／Ｌ，但??與文獻報道產(chǎn)量還有一定差距［２９］。通過進一步優(yōu)化發(fā)酵條件和純化步驟，尤其運??３０??
【參考文獻】

相關期刊論文 前5條

1 劉子銘;崔慧斐;;抗腫瘤活性的肝素衍生物研究進展[J];藥物生物技術;2013年03期

2 嚴子琴;黃海嬋;王暢;趙雷;鐘衛(wèi)鴻;;低分子肝素制備的研究進展[J];中國生化藥物雜志;2012年06期

3 張治云;凌沛學;王鳳山;張?zhí)烀?;低分子肝素臨床應用的研究進展[J];中國生化藥物雜志;2006年04期

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1 胡貴新;不同修飾模式的肝素寡糖的化學酶法合成及肝素酶的底物特異性研究[D];山東大學;2017年

2 周岳;桑色素在動脈粥樣硬化中抗炎作用的分子機制研究[D];山東大學;2016年

本文編號：2893417