發(fā)布時間：2020-11-10 12:11

【摘要】：為了研究鎘(Cadmium,Cd)暴露對人腎小管上皮細胞(HK-2)的毒性作用,本研究使用CdCl_2脅迫體外培養(yǎng)的HK-2細胞,通過MTT實驗、光鏡觀察、流式細胞術、熒光染色、彗星實驗、Western Blot等實驗方法,檢測了CdCl_2對HK-2細胞氧化損傷及凋亡的影響;通過CdCl_2與NAC共處理HK-2細胞,以探究ROS在CdCl_2引起的HK-2細胞發(fā)生氧化損傷及凋亡中的作用。以及建立小鼠Cd中毒模型,檢測小鼠腎臟組織中幾種重要抗氧化酶的活性以及脂質(zhì)過氧化物的含量,HE染色法觀察腎臟組織顯微結(jié)構的改變,同時統(tǒng)計小鼠腎臟系數(shù)。研究旨在探索Cd暴露對腎臟損傷的毒性機制,為預防重金屬Cd中毒以及臨床治療提供理論依據(jù)。實驗結(jié)果如下:1.體外實驗發(fā)現(xiàn),與對照組相比,CdCl_2處理顯著降低了HK-2細胞的活力,呈現(xiàn)出明顯的時間-劑量-效應關系;光學顯微鏡觀察HK-2細胞的形態(tài)發(fā)現(xiàn),CdCl_2處理后HK-2細胞逐漸皺縮、變圓、脫落;熒光顯微鏡觀察及流式細胞術的結(jié)果顯示,CdCl_2處理后HK-2細胞內(nèi)ROS含量明顯上升且線粒體膜電位下降;彗星實驗及Western Blot結(jié)果顯示,CdCl_2處理可導致HK-2細胞DNA斷裂及γ-H2AX蛋白的表達量顯著增加,說明CdCl_2引起了HK-2細胞DNA損傷,且與ROS的生成有關;而Hoechst染色結(jié)果也表明,HK-2細胞出現(xiàn)染色質(zhì)凝聚、核固縮碎裂的現(xiàn)象;Western Blot實驗結(jié)果顯示,CdCl_2處理后caspase-3發(fā)生活化,說明Cd處理可以引起HK-2細胞線粒體損傷和凋亡。與CdCl_2處理組相比,NAC與CdCl_2共同處理可以減少細胞形態(tài)改變;抑制細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生;且減輕了DNA的損傷程度,緩解了細胞的凋亡情況,表明CdCl_2對HK-2細胞的毒性損傷與ROS有關。2.動物實驗發(fā)現(xiàn),與對照組相比,CdCl_2處理組的小鼠腎臟組織中GSH-Px和CAT的活性在19 d時明顯降低;SOD活性在相同處理時間條件下,隨著濃度的增加出現(xiàn)先升高后降低的趨勢;MDA含量則呈現(xiàn)升高趨勢;HE染色結(jié)果顯示,腎小管上皮細胞出現(xiàn)顆粒變性,部分細胞脫落,或固縮壞死。結(jié)論:1.Cd能夠引起ROS大量積累,從而引起HK-2細胞線粒體膜電位下降及DNA損傷等一系列氧化應激反應,并最終導致細胞發(fā)生凋亡,初步表明Cd可通過ROS介導的氧化損傷引起腎小管上皮細胞凋亡。2.Cd暴露可以破壞小鼠腎臟組織抗氧化酶系統(tǒng)活性,導致腎小管上皮細胞損傷甚至壞死,進一步證明氧化損傷可對腎小管上皮細胞產(chǎn)生毒性損傷。
【學位授予單位】：山西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R114
【圖文】：

本學位論文的實驗設計

第二章 鎘通過 ROS 累積引起 HK-2 細胞氧化損傷及凋亡2 結(jié) 果2.1 CdCl2對 HK-2 細胞活性的影響用不同濃度 CdCl2（0、30、60、90 μmol/L）處理 HK-2 細胞 24 h 或者用 60 μmol/L處理 HK-2 細胞不同時間（0、12、24、36、48 h）后，通過 MTT 實驗檢測 CdCl2對HK-2細胞活性的影響。結(jié)果表明，使用60、90 μmol/L CdCl2處理24 h或者用60 μmol/L處理 24、36 和 48 h 后，細胞活性顯著降低（P<0.01），由圖 2.1 可知，隨著 CdCl2處理濃度的增大以及處理時間的延長 HK-2 細胞活性逐漸降低，并呈現(xiàn)時間-劑量-效應關系，說明 CdCl2脅迫可以抑制 HK-2 細胞的活性。

圖 2.2 CdCl2處理后 HK-2 細胞形態(tài)的變化情況A：不同濃度 CdCl2條件處理下，HK-2 細胞 24 h 后的形態(tài)變化情況；B：60 μmol/L CdCl2處理不同時間后對 HK-2 細胞形態(tài)的影響。Fig 2.2 Morphological changes of HK-2 cells after CdCl2treatmentA: Morphological changes of HK-2 cells after 24 h treatment under different concentrations of CdCl2;B: Effects of 60 μmol/L CdCl2on the morphology of HK-2 cells after different time.2.3 CdCl2對 HK-2 細胞 ROS 水平的影響通過熒光顯微鏡觀察 DCFH-DA 探針標記的綠色熒光信號發(fā)現(xiàn)，不同濃度的CdCl2處理細胞 24 h 后，30 μmol/L 濃度處理下觀察到少量 ROS 熒光生成，且隨著CdCl2濃度的增加，ROS 熒光信號逐漸增強，在 90 μmol/L 濃度條件下 ROS 熒光明顯增強（圖 2.3A）。同時流式細胞術檢測到 ROS 的生成量在 60 μmol/L 濃度條件下顯著升高（P＜0.01），在 90 μmol/L 濃度處理下 ROS 達到最大值（圖 2.3 B），使用 500 μmol/L 的 NAC 與 60 μmol/L CdCl2共處理 24 h 后，發(fā)現(xiàn) ROS 熒光信號較 60
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